ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ АНТИБИОТИКОВ ТЕТРАЦИКЛИНОВОЙ ГРУППЫ В КОРОВЬЕМ МОЛОКЕ С ПРИМЕНЕНИЕМ ЭКСПРЕСС-ТЕСТОВ

АННОТАЦИЯ

Целью исследования является изучение остаточных количеств антибиотика окситетрациклина из группы тетрациклинов в образцах молока, с применением иммунохроматографического метода анализа. Проведён анализ трёх образцов коровьего молока, собранного на фермерском хозяйстве с периодичностью и интерпретированы полученные результаты исследования. Результаты анализа показали наличие остаточных количеств окситетрациклина в образцах молока, не смотря на истечения карантинного срока в семь дней при введении данного препарата животному. Что является показателем актуальности тематики остаточных количеств антибиотиков в молоке и молочных продуктах и надлежащим контролем за их наличием в продуктах питания.

ABSTRACT

The aim of this study is to explore the residual amounts of antibiotic oxytetracycline from the tetracycline family in milk samples using immunochromatographic analysis. Three samples of cow’s milk were collected from a farm on a regular basis and analyzed. The results were interpreted. The results of the analysis showed the presence of residual amounts of oxytetracycline in milk samples, despite the expiration of the quarantine period of seven days when this drug was administered to an animal. This is an indicator of the relevance of the topic of residual amounts of antibiotics in milk and dairy products and proper monitoring of their presence in food.

Ключевые слова: антибиотики, остаточное количество антибиотиков, окситетрациклин, экспресс-тесты.

Keywords: antibiotics, residual amount of antibiotics, oxytetracycline, rapid tests.

Введение. Антибиотики широко применяются для лечения многих бактериальных инфекций и воспалительных заболеваний у людей и животных. В сельском хозяйстве у крупного рогатого скота применение этих синтетических соединений носит либо профилактический характер для предотвращения заболеваний, либо лечебный, прежде всего для лечения мастита у дойных коров [1].

Во время лечения, независимо от вида заболевания или профилактического применения антибиотиков, дойных коров следует содержать в карантинном отделении фермы изолированно от всего основного стада. Молоко от лечащихся дойных коров необходимо выбрасывать и ни в коем случае не подвергать переработке на протяжении всего периода изоляции от лечения антибиотиками и во время выведения антибактериальных препаратов из организма коровы [2].

В широко известных и крупных хозяйствах все вышеперечисленные требования тщательно соблюдаются, однако, в мелких хозяйствах часто случаются нарушения этих санитарных требований.

Употребление молока и молочных продуктов в составе которых присутствует остаточное количество антибактериальных препаратов, могут привести к различным неблагоприятным последствиям для здоровья человека, таким как канцерогенность, мутагенность, тератогенность, нефропатия, нарушение репродуктивной функции, гепатотоксичность и аллергические реакции [3-4].

Поэтому является очень важным контролировать уровень остаточных количеств антибиотиков в молочном сырье и готовых к продаже молочных продуктах. Кроме этого, остаточные количества антибиотиков делают молочное сырьё непригодным для производства кисломолочных продуктов, так как ингибирует рост и размножение специальных культур микроорганизмов [5, 6].

Надлежащий ветеринарный надзор за антибиотиками требует специальных, чувствительных и надежных аналитических методов, которые могут обнаружить все остатки антибиотиков в соответствие регламентированных значений [7]. Существуют различные аналитические методы определения остатков антибиотиков в молоке и мясе, включая хроматографию, иммунохимию и биосенсорные тесты [8].

Методы, используемые для обнаружения, обычно зависят от типа противомикробного препараты, ожидаемых временных ограничений, селективности и стоимости. Методы измерения остатков противомикробных препаратов могут носить качественный или количественный характер [9]. Примененный в данном исследование метод является качественным анализом с визуальным интерпретированием.

Материалы и методы исследования.

Иммунохроматографический метод анализа или ИХА является методом идентификации присутствия установленной концентрации вещества в биологических материалах таких как молоко, сыворотка или плазма, кровь, слюна и др.  

Этот вид анализа проводится с использованием индикаторных палочек, полосок с реагентом, панелей или тест-кассет, которые дают возможность получить результаты анализа в кротчайшие сроки. По своей сути, ИХА является сравнительно новой аналитической методикой, которая встречается в литературных данных также часто называют сухой иммунохимией, rapid test, экспресс-тестом или экспресс-анализом. Применение таких названий связано со скорость данного метода анализа [10].

Для проведения анализа отобрали пробы молока у коровы после введения антибиотика Troxylin 200 LA (в 1 мл раствора содержится 200 мг окситетрациклина) в профилактических целях [11]. Раствор антибиотика вводился 2 раза по 22 мл затем был проведён отбор проб на третий, седьмой и десятый день после инъектирования препарата.

В процессе исследования применяли экспресс-тесты компании PIONEER MEIZHENG BIO-TECH, страна производитель Китай предназначенные для определения остаточных количеств β-лактамов, тетрациклиновой группы, хлорамфеникола и стрептомицинов в молоке и молочной сыворотке.

Рисунок 1. Образец №1. Отобранный на третий день после инъекций;

Образец №1. Отобранный на седьмой день после инъекций;

Образец №1. Отобранный на десятый день после инъекций;

Применённый метод для анализа образцов молока является иммунохроматографическим методом анализа, при котором применяются частицы коллоидного золота. Реагенты с антителами упакованы в лунки входящие в комплект набора, эти антитела при наличии в пробе молока антибиотиков образуют связь с ними. Это предотвращает позднее связывание антитела с антигеном.

Тест-набор состоит из пробирок с лунками-стрипами, содержащими реагенты с антителами, специальных тест-полосок, пипеток емкостью 200 мкл, одноразовых наконечников и луночных планшетов.

 Рисунок 2. Тест-набор PIONEER MEIZHENG BIO-TECH для проведения анализа

Проведение исследования. Перед проведением анализа молока извлекли из холодильника (температура хранения 2-8 ^о С) нужное количество тестов, для того чтобы реактивы согрелись до комнатной температуры. Анализ образцов молока проводили при температуре 22-25 ^о С в закрытом помещении, без использования инкубатора. В планшет поместили нужное для анализа количество лунок с реагентами, образцы молока нагрели на водяной бане до 40 ^о С, затем с помощью пипет-дозатора отобрали по 200 мкл с использованием отдельной одноразовой насадки для каждого образца, перенесли в лунку с реагентом [12].

Каждую пробу тщательно перемешивали с реагентом, путём десятикратного набора и слива смеси образца и реагента с помощью пипетки в лунке, до получения равномерного розового окрашивания. После смесь инкубировали в комнатной температуре на протяжении трёх минут.

После этого, поместили заранее пронумерованную тест-полоску в лунку с реагентом и пробой анализируемого молока и инкубировали на протяжении семи минут в комнатной температуре.

После инкубирования извлекли тест-полоску из лунки с реагентом и пробой и визуально интерпретировали результаты анализа.

Полученные результаты анализа могут быть отрицательными, положительными или недействительными. При получении отрицательного результата, контрольная линия должна быть окрашена в красный, остальные тестовые линии, соответствующие своему типу антибиотиков окрашены красным цветом одинаковой интенсивности или ярче контрольной линии. Это говорит о том, что анализируемый образец молока не содержит антибиотики или содержит их меньше, чем предел обнаружения у тест-набора.

Полученный положительный результат показывает наличие в образце антибиотика, определяемого тест-набором. При этом контрольная линия окрашивается красным, тестовая линия, свойственная своему виду антибиотика отсутствует или окрашена менее интенсивно чем контрольная линия.

При недействительном результате анализа контрольная линия не окрашивается вообще. В таком случае анализ образца проводится повторна, для получения достоверного результата.

Визуальная интерпретация полученных данных, при проведении анализа показывают наличие окситетрациклина во всех трёх образцах молока. О котором, свидетельствует отсутствие во всех трёх тест-полосках тестовой линии соответствующей для антибиотиков тетрациклиновой группы. Кроме этого, в тест-полосках под номером один и три наблюдается отсутствие окрашивания тестовой линии соответствующей группе антибиотиков β-лактамов.

Выводы. Исходя из результатов, полученных при проведении анализа проб молока, можно прийти к выводу о наличии остаточных количеств антибиотиков группы β-лактамов и тетрациклинов. Наличие в молоке остаточных количеств антибиотиков после окончания срока браковки молока указанного в инструкции препарата, то есть семи суток говорит о необходимости увеличения срока выведения из организма животного в целях обеспечения безопасности молока для потребителей. Полученные результаты показывают важность непрерывного контроля остаточных количеств антибиотиков в молоке на фермерских хозяйствах и в пунктах приёмки молока при молокоперерабатывающих заводах для недопущения к переработке и в конечном счёте реализации на рынке несоответствующего требованиям безопасности молока и молочных продуктов.

Список литературы:

1. Martins-Júnior, Helio & Kussumi, Tereza & Wang, Alexandre & Lebre, Daniel. (2007). A rapid method to determine antibiotic residues in milk using liquid chromatography coupled to electrospray tandem mass spectrometry. Journal of the Brazilian Chemical Society// 18. 397-405. 10.1590/S0103-50532007000200023.
2. Абдусаломова Д.О., Азизов О.Т. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ АНТИБИОТИКОВ В ПРОБАХ НАИБОЛЕЕ РАСПРОСТРАНЁННЫХ МАРОК МОЛОКА ПРОИЗВЕДЁННЫХ В УЗБЕКИСТАНЕ // Universum: технические науки: электрон. научн. журн. 2023. 6(111). URL: https://7universum.com/ru/tech/archive/item/15651 (дата обращения: 24.02.2024).
3. Md. Sahidur Rahmana, Mohammad Mahmudul Hassanb, Sharmin Chowdhury. Determination of antibiotic residues in milk and assessment of human health risk in Bangladesh// https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2021.e07739
4. Wright, G. The antibiotic resistome: the nexus of chemical and genetic diversity. Nat Rev Microbiol 5, 175–186 (2007). https://doi.org/10.1038/nrmicro1614.
5. Серёгин И.Г., Данченко Н.И., Михалева Л.П. 2009 Производственный ветеринарно-санитарныйконтроль молока и молочных продуктов: Учебное пособие. (Москва: Deli Print) стр. 403.
6. Tropilo J, Szulc M and Leszczynska K 1985 Pozostalosci penicyliny i innych substancji hamujacych w mleku Rocz. Panst. zakl. Hig 36 (4) 304–9
7. S. E. Kaya and A. Filazi, “Determination of antibiotic residues in milk samples,” Kafkas Univ Vet Fak Derg, vol. 16, pp. 31–S5, 2010. doi.org/ 10.1155/ 2023/ 4380261
8. H. Imamoglu and E. Oktem Olgun, “Analysis of veterinary drug and pesticide residues using the ethyl acetate multiclass/ multiresidue method in milk by liquid chromatographytandem mass spectrometry,” Journal of analytical methods in chemistry, vol. 2016, Article ID 2170165, 2016.//doi.org/10.1155/2016/2170165
9. S. Forouzan, A. Rahimirad, R. Seyedkhoei, J. Asadzadeh, and M. Bahmani, “Determination of antibiotic residues in the pasteurized milk produced in West Azerbaijan province, North West of Iran” Journal of Coastal Life Medicine, vol. 2, no. 4, pp. 297–301, 2014. DOI:10.12980/JCLM.2.201414J8
10. https://apk.hlr.ua/ru/articles/czena-nesoblyudeniya-instrukczij-k-ekspress-testam-moloka (дата обращения 29.02.2024 г.)
11. https://www.fq-pharm.com/liquid-injection/oxytetracycline-20-la-injectable-solution.html (дата обращения 23.02.2024 г.)
12. https://pionerprodukt.by/en/production/tests/pioneer-meizheng-bio-tech-5in1-jc0586-testi-na-antibiotiki-5-v-1.html (ПионерПродукт - www.pionerprodukt.by). (дата обращения 23.02.2024 г.)