ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСТРАКТА, СОДЕРЖАЩЕГО ПОЛИФЕНОЛА-АНТИОКСИДАНТА

УДК.661.7

Аннотация

В данной работе представлены результаты исследований, направленных на получение, характеристику и первичную оценку экстракта, выделенного из коры корней Morus nigra L. (чёрной шелковицы), содержащего биологически активное соединение — ресвератрол. Разработана и апробирована лабораторная технология экстрагирования с использованием 70 %-ного этанола в качестве экстрагента, обеспечивающая эффективное извлечение целевого компонента при сохранении фенольных соединений и их биологической активности. Проведённые исследования показали, что выбранные условия экстракции позволяют получать экстракт с высоким содержанием полифенольных веществ и хорошими технологическими характеристиками. Установлено, что полученный экстракт обладает выраженной антиоксидантной активностью, что подтверждает перспективность его дальнейшего изучения и практического применения. Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования данного растительного сырья как доступного природного источника ценных биологически активных соединений. Экстракт представляет интерес для дальнейшего применения в фармацевтической, пищевой и косметической отраслях в качестве источника природных антиоксидантов и полифенольных веществ.

Abstract

This study presents the results of research aimed at the extraction, characterization, and preliminary evaluation of an extract obtained from the root bark of Morus nigra L. (black mulberry), containing the biologically active compound resveratrol. A laboratory-scale extraction technology was developed and tested using 70% ethanol as the extraction solvent, ensuring efficient recovery of the target compound while preserving phenolic compounds and their biological activity. The conducted investigations demonstrated that the selected extraction conditions allow the production of an extract with a high content of polyphenolic substances and favorable technological characteristics. The obtained extract exhibited pronounced antioxidant activity, confirming its potential for further study and practical application. The results indicate that this plant material may serve as an accessible natural source of valuable biologically active compounds. The extract is of particular interest for potential use in the pharmaceutical, food, and cosmetic industries as a source of natural antioxidants and polyphenolic substances.

Ключевые слова: Morus nigra L.; чёрная шелковица; кора корней; ресвератрол; экстракция; антиоксиданты.

Keywords: Morus nigra L.; black mulberry; root bark; resveratrol; extraction; antioxidants.

Введение. Цель исследования: Разработка и изучение технологического процесса получения экстракта из коры корней Morus nigra L. (чёрной шелковицы), обогащённого ресвератролом и сопутствующими стильбеновыми соединениями, с обеспечением максимальной эффективности их извлечения, сохранения биологической активности и оценки перспектив практического применения полученного экстракта.

Задачи исследования

Провести заготовку, подготовку и предварительную обработку коры корней Morus nigra в соответствии с технологическими требованиями, изучить химический состав растительного сырья, определить суммарное содержание фенольных соединений и оценить его антиоксидантный потенциал, подобрать оптимальный экстрагент и условия экстракции для эффективного извлечения ресвератрола и других стильбеновых соединений из коры корней чёрной шелковицы, исследовать влияние различных методов интенсификации экстракционного процесса, оценить возможность применения ферментативной обработки сырья для повышения выхода целевых биологически активных веществ.

Материалы и методы исследования

Объект исследования:

В качестве растительного сырья для исследования использовали корневую кору Morus nigra L. (чёрной шелковицы). Заготовку материала осуществляли в осенне-зимний сезон, когда накопление биологически активных компонентов в тканях растения достигает максимального уровня. После отделения коры от древесной части корней её промывали для удаления загрязнений, высушивали при температуре 40–60 °C до достижения остаточной влажности не более 8–10 %, а затем измельчали до размера частиц 0,5–1,0 мм.

Определение общего содержания фенольных веществ

Количественную оценку суммарных фенольных соединений осуществляли с использованием метода Фолина–Чокальтеу. Исследование антиоксидантной активности определяли методом DPPH. Анализ содержания ресвератрола. Для идентификации и количественного определения ресвератрола применяли комплекс современных аналитических методов, включающих УФ-спектрофотометрию, ИК-спектроскопию и высокоэффективную жидкостную хроматографию.

Ресвератрол (3,5,4'-тригидроксистильбен) представляет собой природное полифенольное соединение класса стильбенов, характеризующееся высокой антиоксидантной активностью. Данное вещество относится к группе фитоалексинов — вторичных метаболитов растений, образование которых стимулируется воздействием различных стрессовых факторов, таких как ультрафиолетовое излучение, механические повреждения тканей, патогенные микроорганизмы и другие неблагоприятные условия окружающей среды. Благодаря выраженным антиоксидантным, противовоспалительным и кардиопротекторным свойствам ресвератрол рассматривается как перспективное биологически активное соединение для использования в фармацевтической, нутрицевтической и косметической промышленности.

Традиционно основным промышленным источником получения ресвератрола являлись корни Polygonum cuspidatum (горца японского). Однако в последние годы всё большее внимание уделяется изучению альтернативных растительных источников данного соединения, отличающихся специфическим профилем и высоким содержанием стильбеновых производных.

Перспективным объектом в этом направлении является черная шелковица (Morus nigra). Растения рода Morus широко применяются в народной медицине стран Азии, где листья, плоды, молодые побеги и корневая кора используются для профилактики и лечения различных заболеваний. Особый интерес представляет кора корней видов Morus nigra и Morus alba, рассматриваемая как ценный природный источник ресвератрола и других соединений стильбеновой природы.

Выбор коры корней черной шелковицы в качестве объекта исследования обусловлен её богатым фитохимическим составом. Установлено, что ткани корневой коры, особенно наружные слои перидермы, содержат значительные количества транс-ресвератрола, оксиресвератрола и ряда олигостильбенов. При этом некоторые из указанных соединений демонстрируют биологическую активность, превосходящую активность самого ресвератрола.

Практическая значимость коры корней шелковицы подтверждается её многолетним использованием в традиционной медицине в качестве противовоспалительного, антибактериального и гипогликемического средства. Подобные фармакологические эффекты связывают с комплексным действием содержащихся в сырье биологически активных веществ, способных проявлять синергизм.

Дополнительным преимуществом данного растительного сырья является его доступность и возможность рационального использования. Поскольку культивирование шелковицы в основном направлено на получение плодов и листьев, корневая кора может рассматриваться как вторичный растительный ресурс. Её переработка способствует более полному использованию растительного сырья и созданию экономически эффективных технологий получения ценных фитохимических продуктов.

В связи с этим настоящее исследование посвящено изучению основных этапов технологического процесса, обеспечивающего максимально эффективное извлечение ресвератрола и сопутствующих стильбеновых соединений из коры корней черной шелковицы.

На начальном этапе исследования растительное сырьё подвергалось предварительной обработке и подготовке к процессу экстракции. Качество получаемого экстракта в значительной степени определяется состоянием исходного сырья и соблюдением технологических требований его подготовки. Заготовку корней шелковицы проводили в осенне-зимний период, когда содержание биологически активных компонентов достигает максимальных значений (рис. 1). Для исследования отбирали корни зрелых растений, обеспечивая при этом минимальное повреждение дерева и сохранение его жизнеспособности.

Кору аккуратно отделяли от древесины корня (декортикация). Именно кора является наиболее богатым ресвератролом слоем (рис-2).

Отделённую кору тщательно очищали от остатков почвы и других механических примесей путём промывания водой. После очистки сырьё подвергали сушке при контролируемой температуре 40–60 °C, что позволяло избежать термической деструкции термолабильных компонентов, включая ресвератрол, температура плавления которого составляет 253–255 °C. Содержание остаточной влаги в высушенном сырье поддерживали на уровне не выше 8–10 %. После высушивания кору измельчали до порошкообразного состояния с использованием сит размером 0,5–1,0 мм. Уменьшение размера частиц способствует увеличению площади контакта между растительным материалом и экстрагентом, что положительно влияет на эффективность массопереноса и выход целевых соединений. На предварительном этапе исследования проводили оценку химического состава растительного сырья. Одним из основных показателей являлось суммарное содержание фенольных соединений, определяемое методом Фолина–Чокальтеу. Принцип метода основан на взаимодействии фенольных веществ с реактивом Фолина–Чокальтеу, содержащим фосфорновольфрамовую и фосфорномолибденовую кислоты. В щелочной среде фенольные соединения восстанавливают данные комплексы с образованием окрашенных продуктов синего цвета. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации фенольных компонентов и определяется спектрофотометрическим методом. В качестве стандартного вещества использовали галловую кислоту. Для анализа применяли этанол, реактив Фолина–Чокальтеу и карбонат натрия (Na₂CO₃). Измерения проводили на спектрофотометре BOYN BNUV-D830 (AC220V/50Hz). Для подготовки образцов дополнительно использовали аналитические весы и вихревой смеситель. Антиоксидантную активность полученных экстрактов определяли методом DPPH, основанным на способности антиоксидантов восстанавливать стабильный свободный радикал 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил. В результате реакции происходит снижение интенсивности фиолетовой окраски раствора, что сопровождается уменьшением его оптической плотности. Для анализа к 100 мкл экстракта различных концентраций добавляли 3,4 мл раствора DPPH• концентрацией 6×10⁻⁵ М. Реакционную смесь выдерживали в тёмном месте при комнатной температуре в течение 45 минут. После инкубации измеряли оптическую плотность растворов при длине волны 517 нм. Количественное содержание ресвератрола в исследуемых образцах определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), который обеспечивает высокую точность идентификации и количественного анализа целевого компонента в сложных растительных матрицах. Одним из важнейших этапов экстракционного процесса является подбор растворителя, определяющего степень извлечения и селективность выделения целевых веществ. Ресвератрол и его гликозидные формы относятся к умеренно полярным соединениям. Наиболее широко используемым экстрагентом является этанол, признанный безопасным растворителем категории GRAS. Согласно литературным данным, оптимальная концентрация водно-этанольного раствора для извлечения ресвератрола составляет 50–80 %. В лабораторной практике в качестве растворителя также может применяться метанол, обеспечивающий высокий выход экстрактивных веществ. Однако его токсичность существенно ограничивает использование в производстве пищевых и фармацевтических препаратов. Наиболее эффективным и безопасным вариантом считается 70 %-ный этанол, обеспечивающий оптимальное сочетание экстрагирующей способности и технологической безопасности. Процесс получения экстракта из коры корней Morus nigra представляет собой сложную многостадийную систему, эффективность которой определяется физико-химическими характеристиками объекта экстракции и параметрами взаимодействия в системе «твёрдое тело – жидкость». Ресвератрол относится к низкомолекулярным полифенольным соединениям, а его извлечение осложняется высоким содержанием лигнина и целлюлозы в корневой коре, создающих дополнительные диффузионные препятствия. К числу факторов, влияющих на стабильность ресвератрола, относятся светочувствительность и термолабильность. Под действием ультрафиолетового излучения происходит изомеризация биологически активного транс-ресвератрола в менее активную цис-форму. В связи с этим все стадии экстракции рекомендуется проводить в условиях защиты от света. Продолжительный нагрев выше 70 °C в присутствии кислорода способствует окислительной деградации стильбеновых соединений. Ресвератрол обладает амфифильной природой благодаря сочетанию ароматического гидрофобного фрагмента и гидрофильных гидроксильных групп. По данным многочисленных исследований, максимальный выход вещества достигается при использовании этанольных растворов концентрацией 60–80 %. Вода способствует набуханию растительных тканей и ослаблению взаимодействия полифенолов с белками и полисахаридами, тогда как этанол эффективно растворяет высвобождающиеся стильбены. Для интенсификации процесса экстракции применяли современные технологии, включая ультразвуковую экстракцию (UAE). Данный метод основан на явлении кавитации, сопровождающемся образованием и разрушением микропузырьков газа. Возникающие при этом локальные ударные волны способствуют разрушению клеточных структур и ускоряют переход биологически активных веществ в растворитель. Использование ультразвука позволяет сократить продолжительность процесса до 15–30 минут и проводить экстракцию при комнатной температуре. В качестве сравнительного метода использовали экстракцию в аппарате Сокслета, основанную на многократной циркуляции нагретого растворителя через слой растительного сырья. Данный способ обеспечивает практически полное истощение сырья, однако длительное воздействие повышенной температуры может приводить к снижению содержания транс-ресвератрола. Поэтому в современных исследованиях метод Сокслета чаще применяется как эталонный для оценки максимально возможного выхода биологически активных веществ. Дополнительно исследовали возможность использования сверхкритической CO₂-экстракции. Применение диоксида углерода в сверхкритическом состоянии позволяет получать экстракты высокой степени чистоты без остаточных количеств органических растворителей. Поскольку сверхкритический CO₂ обладает преимущественно неполярными свойствами, для повышения эффективности извлечения ресвератрола в систему вводили этанол в количестве 5–10 % в качестве модификатора. Для идентификации и количественного определения ресвератрола использовали современные инструментальные методы анализа. При УФ-спектрофотометрическом исследовании для ресвератрола характерен максимум поглощения в диапазоне 306–310 нм. Несмотря на простоту метода, его селективность ограничена присутствием других фенольных соединений, содержащихся в коре шелковицы. Анализ ИК-спектров экстракта показал наличие характерных полос поглощения: широкой интенсивной полосы около 3400 см⁻¹, соответствующей валентным колебаниям гидроксильных групп; полос в области 3080 см⁻¹, связанных с ароматическими связями C–H; сигналов около 1580 см⁻¹, обусловленных колебаниями ароматической системы и двойных связей C=C; полосы в области 975 см⁻¹, характерной для транс-конфигурации этиленового фрагмента; а также полосы около 1260 см⁻¹, соответствующей колебаниям фенольной связи C–O.

Рисунок 4. Результаты

Для идентификации и количественного определения ресвератрола в составе полученных экстрактов применяли метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Данный метод обеспечивает эффективное разделение структурно близких соединений, включая изомеры ресвератрола и родственные стильбеноиды. Анализ проводили с использованием обращённо-фазовой хроматографической колонки типа C18. В качестве подвижной фазы применяли градиентную систему ацетонитрил–вода с добавлением 0,1 % муравьиной или фосфорной кислоты, что обеспечивало высокую селективность и воспроизводимость результатов.

С целью повышения эффективности извлечения биологически активных веществ дополнительно использовали ферментативную обработку растительного сырья. Предварительное воздействие целлюлаз и пектиназ способствовало частичному разрушению структурных компонентов клеточных стенок, главным образом целлюлозы и пектиновых веществ. В результате повышалась проницаемость тканей коры и облегчался доступ экстрагента к внутриклеточным структурам, содержащим стильбеновые соединения.

После завершения процесса экстракции полученный раствор подвергали очистке и концентрированию. Для удаления твёрдых частиц растительного происхождения первоначально проводили грубую фильтрацию, после чего осуществляли тонкую фильтрацию через мембранные фильтры с размером пор 0,45 мкм.

Удаление растворителя осуществляли методом вакуумного выпаривания на ротационном испарителе при пониженном давлении и невысокой температуре. Такой подход позволял минимизировать риск термической деградации ресвератрола и других термолабильных компонентов. В результате получали концентрированный жидкий экстракт с повышенным содержанием целевых веществ.

Для получения сухого порошкообразного продукта концентрат подвергали лиофильной сушке. Лиофилизация является одним из наиболее эффективных методов обработки термочувствительных соединений, поскольку процесс протекает при низких температурах и пониженном давлении. Использование данного метода обеспечивает сохранение биологической активности компонентов экстракта и предотвращает изомеризацию транс-ресвератрола.

Результаты и обсуждение

Проведённые исследования показали, что кора корней Morus nigra L. является перспективным источником ресвератрола и других стильбеновых соединений. Эффективность извлечения биологически активных веществ во многом зависела от качества подготовки сырья. Контролируемая сушка и измельчение способствовали сохранению целевых компонентов и повышению эффективности экстракции.

Установлено, что 70 %-ный этанол является эффективным экстрагентом для выделения полифенольных соединений из коры корней шелковицы. Использование водно-этанольной системы обеспечивало как набухание растительных тканей, так и эффективное растворение стильбенов.

Применение ультразвуковой обработки способствовало интенсификации процесса экстракции за счёт разрушения клеточных структур и ускорения массопереноса. Дополнительное повышение выхода целевых веществ наблюдалось после ферментативной обработки сырья, которая увеличивала проницаемость тканей коры.

Анализ методом Фолина–Чокальтеу подтвердил наличие значительного количества фенольных соединений в полученных экстрактах. Исследование антиоксидантной активности методом DPPH показало выраженную способность экстрактов нейтрализовать свободные радикалы, что свидетельствует о высоком антиоксидантном потенциале растительного сырья.

Результаты спектрального анализа и высокоэффективной жидкостной хроматографии подтвердили присутствие ресвератрола в составе экстрактов. Применение современных аналитических методов обеспечило надёжную идентификацию целевого соединения и его отделение от сопутствующих фенольных компонентов.

Установлено, что сохранение биологической активности ресвератрола зависит от соблюдения щадящих условий экстракции, защиты от света и использования пониженных температур при концентрировании и сушке. Применение вакуумного выпаривания и лиофилизации позволило получить стабильный экстракт с сохранёнными свойствами.

Таким образом, предложенная технология обеспечивает эффективное получение экстракта коры корней чёрной шелковицы, обогащённого ресвератролом и другими стильбеновыми соединениями, что подтверждает перспективность его дальнейшего применения в фармацевтической, нутрицевтической и косметической промышленности.

Заключение

Проведённое исследование позволило обосновать и апробировать технологический подход к получению экстракта из коры корней Morus nigra L., обогащённого ресвератролом и другими соединениями стильбеновой природы. Установлено, что применение 70 %-ного этанола обеспечивает эффективный переход биологически активных веществ в экстракт при одновременном сохранении их структурной стабильности и выраженной антиоксидантной активности.

Показано, что предварительная обработка растительного сырья, использование ультразвуковой интенсификации процесса и соблюдение мягких технологических режимов существенно повышают эффективность извлечения целевых компонентов. Результаты инструментального анализа, включая спектроскопические методы и высокоэффективную жидкостную хроматографию, подтвердили наличие ресвератрола в полученных образцах.

Данные по содержанию фенольных соединений и антиоксидантной активности свидетельствуют о высоком биохимическом потенциале коры корней чёрной шелковицы как природного источника полифенолов. В целом полученные результаты подтверждают перспективность дальнейшего использования данного растительного сырья для разработки фармацевтических, нутрицевтических и косметических средств на основе природных антиоксидантов.

Список литературы:

1. Бердиева З.М., Мирзаева Ш.У. Экстракция масла цветков джиды сверхкритической углекислотой // Интеграция современных научных исследований в развитие общества. – 2016. – С. 181–183.
2. Бердиева З.М., Жахонов Ж., Мирзаев А. АНАЛИЗ РАСТИТЕЛЬНОГО ПОЛИФЕНОЛА // SCIENTIFIC ASPECTS AND TRENDS IN THE FIELD OF SCIENTIFIC RESEARCH. – 2023. – Т. 1. – С. 284–287.
3. Государственная фармакопея РФ (XV издание). Общая фармакопейная статья «Экстракты» (ОФС.1.4.1.0021.15). – Москва, 2023. (Требования к качеству и методам получения растительных экстрактов). Москва, 2023.
4. Жумаев Ж.Х., Шарипова Н.У. Структурно-механические характеристики композиций на основе электрохимического модифицированного крахмала и полимеров // Universum: химия и биология. – 2019. – С. 74–76.
5. Мухаммадиева З.Б., Бердиева З.М. Пищевая безопасность СО2-экстрактов из растительного сырья // Universum: химия и биология. – 2020. – С. 8–12.
6. Мухиддинова Б.З. 1. Muhiddinovna B.Z. Functions and forms of chemical experiment // European science review. – 2020. – № № 1 – 2. – P. 48–50.
7. Хасанова С.Р. Разработка технологии получения и методов стандартизации многокомпонентных растительных экстрактов: автореферат дис. докт. фарм. наук. – Пермь, 2018. (Методологические подходы к стандартизации экстрактов, содержащих фенольные соединения). – 2018.
8. Шарипова Н.У., Мухамадиев Б.Т., Шарипова Н.У. ХРАНЕНИЕ, ТРАНСПОРТИРОВКА И РЕАЛИЗАЦИЯ КРИО ИЗМЕЛЬЧЕННЫХ И ЗАМОРОЖЕННЫХ ПРОДУКТОВ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ // Universum: технические науки. – 2021. – С. 100–103.
9. Шарипова Н.У. Химическая промышленность и окружающая среда // Universum: химия и биология. – 2022. – С. 19–21.
10. Ercisli, S., et al. (2010). “Phenolic composition and antioxidant activity of black mulberry (Morus nigra) from different regions.” Food Chemistry, 121(4), 1171–1175.
11. Rimando, A.M., et al. (2004). “Resveratrol and pterostilbene content in mulberries.” Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52(4), 854–859.

References:

1. Berdieva Z.M., Mirzaeva Sh. U. [Extraction of Sea Buckthorn Flower Oil by Supercritical Carbon Dioxide] // Integratsiya sovremennykh nauchnykh issledovanij v razvitie obshchestva. – 2016. – S. 181–183 (In Russian).
2. Berdieva Z.M., Zhakhonov Zh., Mirzaev A. [Analysis of Plant Polyphenols] // SCIENTIFIC ASPECTS AND TRENDS IN THE FIELD OF SCIENTIFIC RESEARCH. – 2023. – T. 1. – S. 284–287 (In Russian).
3. Gosudarstvennaya farmakopeya RF (XV izdanie). [General Pharmacopeial Article 'Extracts' (OPS.1.4.1.0021.15)] . – Moskva, 2023. (Trebovaniya k kachestvu i metodam polucheniya rastitel'nykh ekstraktov). Moskva, 2023 (In Russian).
4. Zhumaev Zh. Kh., Sharipova N.U. [Structural-Mechanical Characteristics of Compositions Based on Electrochemically Modified Starch and Polymers] // Universum: khimiya i biologiya. – 2019. – S. 74–76 (In Russian).
5. Mukhammadieva Z.B., Berdieva Z.M. [Food Safety of CO2-Extracts from Plant Raw Materials] // Universum: khimiya i biologiya. – 2020. – S. 8–12 (In Russian).
6. Мухиддинова Б.З. 1. [Muhiddinovna B.Z. Functions and Forms of Chemical Experiment] // European science review. – 2020. – № № 1 – 2. – P. 48–50 (In Russian).
7. Khasanova S.R. [Development of Technology for Obtaining and Methods of Standardization of Multicomponent Plant Extracts: Doctoral Dissertation Abstract in Pharmaceutical Sciences] . – Perm', 2018. (Metodologicheskie podkhody k standartizatsii ekstraktov, soderzhashchikh fenol'nye soedineniya). – 2018 (In Russian).
8. Sharipova N.U., Mukhamadiev B.T., Sharipova N.U. [Storage, Transportation and Distribution of Cryo-Ground and Frozen Products of Plant Origin] // Universum: tekhnicheskie nauki. – 2021. – S. 100–103 (In Russian).
9. Sharipova N.U. [Chemical Industry and the Environment] // Universum: khimiya i biologiya. – 2022. – S. 19–21 (In Russian).
10. Ercisli, S., et al. (2010). “Phenolic composition and antioxidant activity of black mulberry (Morus nigra) from different regions.” Food Chemistry, 121(4), 1171–1175.
11. Rimando, A.M., et al. (2004). “Resveratrol and pterostilbene content in mulberries.” Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52(4), 854–859.