ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ, ПОЛИФЕНОЛОВ В ЛИСТЬЯХ ВИНОГРАДА СОРТОВ МУСКАТ ЧЁРНЫЙ И КИЗИЛ ХУРМОНИ

АННОТАЦИЯ

В пищевой промышленности мира проводятся научные исследования по переработке сырья, богатого углеводами, белками, минералами, витаминами, органическими кислотами, полифенолами, а также по производству высокакачественных консервов и развитию других смежных отраслей. Определены содержание органических кислот в листьях винограда, результаты экспериментов по определению винной, лимонной, щавелевой, янтарной кислот также состав и содержание полифенолов в листьях винограда сортов мускат чёрный и кизил хурмони на примере рутин кверцетин  хлорогинная кислота методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

ABSTRACT

The global food industry is conducting scientific research into the processing of raw materials rich in carbohydrates, proteins, minerals, vitamins, organic acids, and polyphenols, as well as the production of high-quality canned goods and the development of other related industries. The content of organic acids in grape leaves has been determined, along with the results of experiments to determine tartaric, citric, oxalic, and succinic acids, as well as the composition and content of polyphenols in the leaves of the Black Muscat and Khurmoni grape varieties, using rutin, quercetin, and chlorogenic acid as examples, using reversed-phase high-performance liquid chromatography (HPLC).

Ключевые слова: листья винограда, лимонная, янтарная, щавелевая кислота, рутин, кверцетин хлорогинная кислота метод обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Keywords: grape leaves, citric, succinic, oxalic acid, rutin, quercetin, chlorogenic acid, reversed-phase high-performance liquid chromatography (HPLC) method.

Введение. В мире сельское хозяйство является основным источником обеспечения населения свежими и переработанными продуктами растительного происхождения, для чего решены задачи сбора, хранения, глубокой переработки сырья, совершенствования технологий, продвижения местных продуктов питания на мировые рынки, повышения их конкурентоспособности. При этом важно расширять ассортимент продукции высокого качества, обладающего повышенной калорийностью и богатым химическим составом, предоставлять консервы с улучшенными органолептическими характеристиками, отвечающими по качеству международным стандартам.

В пищевой промышленности мира проводятся научные исследования по переработке сырья, богатого углеводами, белками, минералами, витаминами, органическими кислотами, полифенолами, а также по производству высокакачественных консервов и развитию других смежных отраслей.

На основе принятых в этом направлении мер особое внимание уделяется эффективному использованию натурального сырья и продукции в производственном  секторе,  увеличение производства  новых видов продукции, снижение себестоимости готовой продукции, а также обеспечению населения качественныи и безопастными продуктами питания, повышению  пищевой, биологической и энергетической ценности в отраслях промышленных предприятий.

В листьях винограда имеются винная, лимонная, янтарная, щавелевая кислоты, определяются методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). ВЭЖХ является универсальным методом количественного анализа органических кислот, широко применяется в пищевой и фармацевтической промышленности.

Органические кислоты являясь важными вкусовыми компонентами продуктов питания, выступают в качестве индикаторов их качества или, наоборот, порчи при хранении. Наличие органических кислот в продуктах питания активизирует пищеварительную железу и способствует лучшему усвоению пищи организмом.

Органические кислоты алифатического или ароматического ряда разнообразны по своей структуре, широко распространены в растениях и выполняют важные биологические и фармакологические функции.

Результаты и обсуждение. Разделение органических кислот проводили с использованием жидкостного хроматографа «Agilent Technologies-1200» (Agilent Technologies, США), оборудованного насосом, обеспечивающим одновременную подачу 4-х растворителей, устройством для автоматического ввода проб термостатом хроматографических колонок, УФ-детектором Agilent 1200 и программным обеспечением обработки хроматографических данных Chem Station. Неподвижная фаза – колонка Agilent C₁₈ 5мкм, 4,6х250 мм. Разделение органических кислот проводили в изократическом режиме элюирования,  Подвижная фаза: 0,1% ортофосфатной кислоты и ацетонитрила в соотношении (95:5). Скорость  подачи  элюента – 1,5 мл/мин.  Температура  колонки –25°C. Детектирование проводили при длине волны λ=210 нм, температура колонки –30^oC, объем инъекции – 10 μl. Использовались xимические реактивы и элюенты фирмы “Sigma-Aldrich” со степенью чистоты > 99,9 % (gradient grade, for HPLC).

Навески стандартных образцов органических кислот растворяли в 1 мл дистиллированной воды в специальныx пробиркаx для анализа. С целью освобождения от меxаническиx и нерастворившиxся мелкиx частиц, которые могут загрязнять хроматографические колонки, вызывая быстрое снижение эффективности, растворы фильтровали с применением фильтра с размером пор 0,2 мкм, затем растворы образцов вставляли в специальный отсек xроматографа, предназначенный для анализируемыx образцов, и проводили анализ по разработанному методу. Центрифугировали 10 мин при скорости 8000 об/мин для освобождения от протеинов. Для каждого анализа объем инъекции составил 10 мкл. Результаты анализа отображались на мониторе компьютера в виде xроматограммы, а программное обеспечение позволяло автоматически интегрировать полученные пики.

На рис.2.1 представлена хроматограмма стандартного раствора органических кислот. Идентификацию проводили по временам удерживания, которые предварительно определяли путем хроматографического анализа каждой кислоты отдельно.

Рисунок 1. Хроматограмма органических кислот образца мускат черный: винная кислота

Также имеются хромотограммы лимонной, янтарной и щавелевой кислот для сорта мускат чёрный и хромотограммы всех четырёх кислот для сорта винограда кизил хурмони.

Согласно предварительным хроматографическим экспериментам, установлено, что лучшее разделение органических кислот обеспечивается при использовании УФ-детектора и в режиме изократического элюирования.

Таблица 1.

Содержание органических кислот в составе виноградных листьев

Анализ табличных данных показывает, что в виноградных листьях преобладает  винная кислота, также как и в плодах, общее количество органических кислот в листьях муската чёрного составляет 5,18 м-экв  мг/100г,  а в листьях сорта кизил хурмони 11,81 м-экв  мг/100г.

Исследовали состав полифенолов листьев винограда мускат чёрный и кизил хурмони селекции института «Садоводства, виноградарства и виноделия» им. акад. М.Мирзаева. Критерием выбора сортов для исследования стали различия в изменении окраски листьев этих сортов в октябре: листья винограда сорта мускат чёрный осенью сохраняли зеленую окраску, сорта кизил хурмони - становились красновато-фиолетовыми. Листья собирали в 2019 г. в конце июня (период максимальной продолжительности светового дня) и в конце октября.

Экстракт из высушенных и измельченных листьев готовили настаиванием в 60 %-м изопропаноле из расчета 1:20 в течение 5 сут в соответствии с методикой. 

Полифенолы анализировали методом ВЭЖХ в хроматографической системе (Sigma-Aldrich, США) с использованием обращенно-фазовой колонки Microsorb-MV C18 (длина 150 мм, диаметр 4,6 мм, диаметр зерна сорбента 5 мкм). Элюент - система метанол и 0,9%-й водный раствор фосфорной кислоты. Режим хроматографирования - градиентный, был разработан и применялся нами ранее для качественного разделения отдельных фенольных кислот и флавоноидов в растительных экстрактах.

Вещества в экстрактах идентифицировали путем сравнения времени удерживания и спектральных характеристик исследуемых веществ с аналогичными показателями стандартов. Спектральные характеристики веществ и степень их сходства со стандартами определяли на основе результатов сканирования экстрактов при 225, 255, 286 и 350 нм в соответствии с разработанным способом идентификации полифенолов. Использовали следующие внешние стандарты: рутин, кверцетин и хлорогеновая кислота, (Sigma-Aldrich, США).

Идентификационные характеристики перечисленных стандартов получали при описанных выше условиях хроматографирования. Калибровочные графики площадь пика-содержание были линейными, имели точность не ниже r²=0,994.

Флавонол глюкуронид кверцетина (кверцетин-3-О-b-D-глюкуронид) идентифицировали на хроматограммах при 255 нм по самому высокому пику согласно литературным данным о наибольшей доле этого вещества в массе полифенолов в листьях винограда [52;С.110-113.58;100-105.59;С.3-11;92 P. 565-572], идентифицировали по самому высокому пику вещества со спектральными характеристиками кофейной кислоты, отличающемуся временем удерживания, на основе данных о содержании кофейной кислоты в листьях винограда преимущественно в этерифицированной форме, отличной от хлорогеновой кислоты - в виде кафтаровой кислоты.  

Содержание веществ с установленной принадлежностью к конкретным группам флавоноидов определяли с использованием стандартов, степень сходства с которыми была наибольшей, с учетом химической формы вещества (агликон, гликозид). Вещества, степень сходства которых с каким-либо стандартом была ниже 70%, относили к группе неидентифицированных, а их содержание определяли по стандартам, степень сходства с которыми была наибольшей.

Принадлежность веществ к антоцианам в листьях винограда сортов мускат чёрный и кизил хурмони устанавливали по пикам хроматограмм при 530 нм. Глюкозиды дельфинидина, цианидина, петунидина, пеонидина, мальвидина идентифицировали по сходству времени удерживания исследуемых антоцианов с аналогичными параметрами перечисленных глюкозидов вина мускат по разработанному ранее способу. Содержание идентифицированных и неидентифицированных антоцианов определяли по цианидину.

Общее количество полифенолов находили суммированием содержания веществ, выявленных в диапазоне пиков флавоноидов и фенольных кислот.

Анализ выполняли в трех повторностях для каждого сорта и срока отбора. Результаты обработаны статистически на основе общепринятых математических методов с применением t-критерия Стьюдента.

Таблица 2.

Содержание отдельных полифенолов в листьях винограда сортов мускат чёрный и кизил хурмони в июне и октябре 2019 г. (мг/г сухого вещества)

Выводы. Определены содержание органических кислот в листьях винограда, результаты экспериментов по определению винной, лимонной, щавелевой, янтарной кислот для сортов винограда кизил хурмони  кора мускат приведены в таблице показано, что в листьях винограда количество янтарной кислоты больше чем остальные.

Определены состав и содержание полифенолов в листьях винограда сортов мускат чёрный и кизил хурмони на примере рутин кверцетин  хлорогинная кислота, их количество в избранных сортах колеблется в пределах 1,12-9,8  мг/%. 

Список литературы:

1. Абдуқаҳҳаров А. Получение высоких урожаев крупноягодных сортов винограда на галечниковых почвах Наманганской области. «Вопросы интенсивной технологии возделывания плодовых пород и винограда», Т.: 1991. -С. 16-25
2. Джавакянц Ю.М., Джавакянц Ж.Л., Алёхин К.К Корневая система плодовых пород и винограда в Узбекистане. Т.: 1981. -С. 45-58.
3. Мирзаев М.М. Виноградарство предгорногорной зоны Узбекистана. Т.: 1980. -С. 16-28
4. Саввин П.Н., Е.В.Комарова., В.М.Болотов., У.С.Шичкина. Исследование натуральных каротиноидно-антоциановых красителей. Химия растительного сырья. 2010. №4. –С. 135-138.
5. Дейнека В.И. Исследование антоцианов черники в плодах и препаратах на ее основе/ В.И.Дейнека[и др.]// Заводская лаборатория. -2006. - №3.-С.16-20.
6. Рахимхонов З.Б., Содиков А.С., Исмоилов А.И., Каримджанов А.К. Исследование антоцианов. Химия природных соединений. 1970. С. 129-130.
7. Атакулова Д.Т., Джураева Г.Х. (Карши, Узбекистан) Химический состав и свойства виноградных листьев. МАТЕРИАЛЫ XXVІІ Международной научно-практической интернет-конференции «Проблемы и перспективы развития науки в начале третьего тысячелетия в странах Европы и Азии» 29 – 30 июня. Сборник научных трудов. Переяслав-Хмельницкий – 2016 С. 278-279.
8. Левицкий А.П., Ходаков И.В., Райцева Е.С. Экстракция полифенолов из листьев винограда // Харчова наука і технологія. -2012. № 3. -С. 36-37.
9. Атакулова Д.Т. Получение биологически безопасного экологически чистого пищевого продукта при применении виноградных листьев для приготовления во многих кухнях мира Iscience, Актуальные вызовы современной науки XXVI ХХVІ Международная научная конференция Сборник научных трудов,  Переяслав-Хмельницкий. №6(26) 26-27 июня 2018 г С.32-34
10. Атакулова Д.Т., Додаев К.О.  Лечебные свойства нетрадиционного сырья, листьев винограда и их использование при приготовлении популярных блюд // Universum: Технические науки. Москва. №6, 2019. –С. 71-73.
11. Атакулова Д.Т., Додаев К.О. Экспериментальные результаты и оптимизация переработки определение содержания общих липидов жирных кислот в том числе, нейтральных (нл), глико (гл) - и фосфо (фл) - липидов ГЖХ  в сухих листьях винограда Universum: Технические науки. Москва. №7, 2020 -С. 36-39.
12. Atakulova D.T. Количественное определение белков The 11-th International scientific and practical conference “Perspectives of world science and education” (July 15-17, 2020) CPN Publishing Group, Osaka, Japan.2020.-С.56-62.
13. Атакулова Д.Т. Джавланова А.С. Польза нетрадиционного сырья, листьев винограда при употреблении для организма человека и используемых из них популярных блюд как долма Наука и образование: проблемы, идеи, инновации Междисциплинарный научный журнал, 2019, Уфа №5(17). С.11-13.
14. Atakulova D.T., Dodaev K.O. Chemical composition and nutritional value grape leaves. International scientific and technical journal «Innovation technical and technology». Vol. 2, №1. 2021. -Р.59-63.
15. Атакулова Д.Т., Додаев К.О. Определение витаминов методом обращено -фазовой ВЖХ. Сборник тезисов международной научно-технической конференции «Актуальные проблемы инновационной технологии в развитии химической нефте-газовой и пищевой промышленности. Ташкент 2021. -С. 277.