СРАВНЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ РАЗЛИЧНЫХ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ПРИ ГИДРОЛИЗЕ ШКУРЫ СЕВЕРНОГО ОЛЕНЯ

АННОТАЦИЯ

Некондиционные шкуры северных оленей представляют собой перспективное сырье для получения гидролизатов коллагена. Одним из основных факторов, определяющих эффективность биотехнологических процессов, является специфичность действия используемых ферментов. Учитывая ограниченную доступность ферментных препаратов на российском рынке, необходим оптимальный выбор препарата, обладающего требуемыми свойствами для максимальной эффективности процесса ферментативного гидролиза. Нами проведено сравнение способности протеаз с различной специфичностью действия к гидролизу желатинизированного коллагена из шкуры северного оленя. Установлено, что наибольшей способностью обладали препараты бактериальной сериновой протеазы – Алкалаза и Протолихетерм, обеспечившие переход в растворимое состояние более 90% белка. Удовлетворительные результаты были получены при использовании Протосубтилина и Протеазы С. Грибная кислая протеаза Пенициллопепсин не обладала способностью к интенсивному гидролизу данного вида субстрата и не может быть рекомендована к использованию в процессе обработки коллагена оленьих шкур. 

ABSTRACT

Substandard reindeer skins represent a promising raw material for obtaining collagen hydrolysates. One of the main factors determining the efficiency of biotechnological processes is the enzymes specificity. Considering the limited availability of enzyme preparations on the Russian market, it is necessary to choose the optimal preparation possessing the required properties for maximum efficiency of the enzymatic hydrolysis process. We compared the ability of proteases with different specificity to hydrolyze gelatinized collagen of reindeer skin. It was established that the bacterial serine protease preparations - Alcalase and Protolichetherm, had the greatest capacity, ensuring the transition of more than 90% of the protein into a soluble state. Satisfactory results were obtained when using Protosubtilin and Protease C. Fungal acid protease Penicillopepsin did not have the ability to intensively hydrolyze this type of substrate and cannot be recommended for the reindeer skin collagen processing.

Ключевые слова: коллаген, шкура северного оленя, гидролиз, протеаза, ферментный препарат

Keywords: collagen, reindeer skin, hydrolysis, protease, enzyme preparation

Ферментативные гидролизаты коллагена широко используются в пищевой, фармацевтической промышленности, в косметологии, с целью придания продуктам необходимых функциональных и биоактивных свойств, а также для повышения пищевой ценности [1]. Перспективным сырьем для получения гидролизатов коллагена являются некондиционные шкуры северного оленя - малоценный вторичный продукт оленеводства [2, 3]. В шкуре животных содержится 30 - 34% коллагена. Из-за жесткой, фибриллярной структуры, стабилизированной ковалентными связями, нативный коллаген практически нерастворим в воде и не поддается действию большинства протеолитических ферментов [4].

Основную роль в деградации коллагена играют коллагеназы, способные расщеплять молекулы в определенных локусах поперек полипептидных цепей на поверхности фибрилл. Однако из-за высокой стоимости препаратов и отсутствия высокоактивных микробных продуцентов, коллагеназы практически не представлены на рынке промышленных ферментов. Большинство протеаз обладает некоторой коллагеназной активностью, однако ее уровень недостаточен для гидролиза нативного коллагена. Тем не менее, протеолитические ферменты, не обладающие выраженной коллагеназной активностью, способны гидролизовать коллаген после водно-тепловой предобработки, в результате которой происходит желатинизация коллагена - разрушение жестких фибриллярных структур с образованием одиночных полипептидных цепей, доступных для действия протеаз. Специфичность используемых протеаз в значительной степени определяет, как интенсивность и полноту гидролиза предобработанного коллагена, так и функциональные свойства полученных гидролизатов [5].

Цель исследований состояла в сравнении эффективности различных микробных ферментных препаратов (ФП) протеолитического действия при гидролизе коллагена шкур северного оленя.

Материалы и методы

В работе использовались ФП: Алкалаза, Протеаза Б (Протолихетерм), Протеаза С, Пенициллопепсин, Протосубтилин.

В качестве субстрата использовали обезволошенную, замороженную шкуру северного оленя. Шкуру размораживали и разрезали на квадраты массой 0,5 г. Образцы помещали в пластиковые контейнеры, заливали 0,05М фосфатным буфером рН 7,0 при гидромодуле 1:6. В варианте с Пенициллопепсином использовали 0,05М ацетатный буфер с рН 5,0.

Ранее, используя метод Мандла, основанный на длительном гидролизе коллагена бычьих Ахилловых сухожилий, во всех исследуемых препаратах определили коллагеназную активность. Препараты дозировали из расчета 5 единиц коллагеназной активности на 1 г сырья.

Предобработку субстрата проводили в течение 30 мин при температуре 95°С. Гидролиз проводили при 40°С на термошейкере в течение 4 ч. По окончании гидролиза ферменты инактивировали инкубированием при 95°С в течение 15 мин, нерастворившийся субстрат отделяли центрифугированием, в супернатанте определяли содержание растворимого белка спектрофотометрическим методом [6] и свободных аминокислот нингидриновым методом. Фракционный состав растворимого белка анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле.

Результаты и обсуждение

Для проведения исследований использовались отечественные и зарубежные ФП протеаз с различной специфичностью действия, применяемые в пищевой и кормовой промышленности для гидролиза широкого спектра белоксодержащего сырья: ФП щелочных сериновых протеаз - Алкалаза, Протеаза Б (Протолихетерм), Протеаза С, ФП кислой аспартатной протеазы - Пенициллопепсин, комплекс щелочной сериновой и нейтральной металлопротеазы – Протосубтилин. Ранее нами было установлено, что все исследуемые препараты проявляют коллагеназную активность на уровне 430±15 ед/г (по методу Мандла), однако такой активности недостаточно для эффективного перевода в растворимое состояние нативного коллагена оленьей шкуры. Поэтому эксперимент проводили с предварительной водно-термической обработкой для разрушения третичной структуры коллагеновых фибрилл и желатинизации коллагена.  

Полученные результаты показали (рис. 1), что наибольшую способность к гидролизу коллагена оленьей шкуры проявили препараты бактериальных протеаз - Протеаза Б, Алкалаза, Протосубтилин, обеспечившие переход в растворимое состояние более 90% белка от его общего содержания.

ФП грибной сериновой протеазы Протеаза С обеспечил выход растворимого белка 70% от его содержания в оленьей шкуре, при этом в гидролизате присутствовало достаточное большое количество свободных аминокислот - 16,5% от общего белка или 20,6% по отношению к растворимому белку.

Наименее эффективным оказался препарат Пенициллопепсин - выход растворимого белка составил менее 40%, свободных аминокислот - менее 5% от общего содержания белка в субстрате. Кроме того, в пробе с Пенициллопепсином остался нерастворенный остаток шкуры, в то время как в остальных вариантах субстрат полностью перешел в суспендированное состояние.

Рисунок 1. Выход растворимого белка (I) и свободных аминокислот (II) при гидролизе образцов оленьей шкуры:

К - без ФП (контроль), 1 - Протеаза Б, 2 - Протеаза С, 3 - Алкалаза, 4 - Протосубтилин, 5 - Пенициллопепсин

Электрофоретический анализ растворимых белков в гидролизатах коллагена оленьей шкуры показал, что желатинизированный, но не обработанный протеазами коллаген состоял из высокомолекулярных белков, основная часть которых характеризовалась ММ выше 50 кДа (контроль). Все исследуемые препараты, кроме Пенициллопепсина, обеспечили расщепление растворимых белков до пептидов с молекулярной массой менее (ММ) 10 кДа. В варианте с Пенициллопепсином в водорастворимой фракции остались выраженные полосы, соответствующие промежуточным продуктам гидролиза коллагена с ММ выше 20 кДа.

Рисунок 2. Электрофореграмма гидролизатов шкуры оленя после обработки различными ФП,

где: М – маркер, 1 - контроль (без ФП), 2 - Протеаза Б, 3 - Протеаза С, 4 - Алкалаза, 5 - Протосубтилин, 6 - Пенициллопепсин

На основании полученных результатов для гидролиза коллагена шкур оленя, желатинизированного с помощью предварительной термообработки, могут быть предложены отечественные препараты - Протолихетерм и Протосубтилин и зарубежный ФП Алкалаза, содержащие бактериальную сериновую протеазу субтилизин.

Исследования проведены в рамках мероприятия НОЦ «Российская Арктика»: Комплексная переработка отходов шкуры северного оленя с разработкой продуктов, обогащенных гидролизатом белка из шкуры северного оленя.

Список литературы:

1. León-López A, Fuentes-Jiménez L, Hernández-Fuentes AD, Campos-Montiel RG, Aguirre-Álvarez G. Hydrolysed Collagen from Sheepskins as a Source of Functional Peptides with Antioxidant Activity// Int J Mol Sci. - 2019. 20(16):3931. doi: 10.3390/ijms20163931.
2. Кротова М. Г. Подбор условий проведения ферментативного гидролиза шкуры марала// Вестник Рязанского государственного агротехнологического университета им. П. А. Костычева. – 2018. - № 3 (39). - С. 93-97.
3. Гордиенко И.М., Белевцова Д.В., Сапожникова А.И., Рассказова Ю.Н., Нурсахедов С.О. Новые возможности в области переработки побочной малоценной коллагенсодержащей продукции оленеводства // Товароведение, технология и экспертиза: инновационные решения и перспективы развития: Материалы национальной научно-практической конференции. – М.: ЗооВетКнига. - 2020. – С. 28-33.
4. León-López A, Morales-Peñaloza A, Martínez-Juárez VM, Vargas-Torres A, Zeugolis DI, Aguirre-Álvarez G. Hydrolyzed Collagen-Sources and Applications// Molecules. - 2019. - 24(22):4031. doi: 10.3390/molecules24224031
5. Al Hajj W, Salla M, Krayem M, Khaled S, Hassan HF, El Khatib S. Hydrolyzed collagen: Exploring its applications in the food and beverage industries and assessing its impact on human health - A comprehensive review// Heliyon. - 2024. 10(16):e36433. doi: 10.1016/j.heliyon.2024.e36433
6. Суховская И.В., Борвинская Е.В., Смирнов Л.П., Немова Н.Н. Сравнительный анализ методов определения концентрации белка спектрофотометрии в диапазоне 200-220 нм и по Бредфорд// Труды Карельского научного центра Российской академии наук. - 2010. - №2. - С.68-71.