IN SILICO, IN VITRO ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ АКТИВНОСТЕЙ ПРЕПАРАТОВ СЕРИИ МЭЭ-1,2,3

АННОТАЦИЯ

В данной работе исследованы соединения N,N'-гексаметилен-бис-[(о-крезолило)-карбамат] т.е. МЭЭ-1, N,N'-гексаметилен-бис-[(м-крезолило)-карбамат] т.е. МЭЭ-2 и МЭЭ-3. Получены прогнозируемые результаты антигельминтной, антибактериальной и других активностей. Соединение МЭЭ-1 в штамме Micrococcus sp. показал значительно более высокую активность, чем стандартный антибиотик, но препараты МЭЭ-2 и МЭЭ-3 не проявили антибактериальных свойств. В результате изучения роста регулирующей активности отмечено, что все препараты МЭЭ серии превышают контроль, но самый лучший результат показал препарат МЭЭ-3; 0,001%-ный раствор МЭЭ-3 увеличил созревание урожая на 98,0%, рост стебля на 130,8% и рост корней на 146,7% за 6 дней.

ABSTRACT

In this work, compounds of the MEE-1,2,3 series were studied. Predicted results of anthelmintic, antibacterial and other activities were obtained. Compound MEE-1 in Micrococcus sp. showed significantly higher activity than the standard antibiotic, but the drugs MEE-2 and MEE-3 did not show antibacterial properties. As a result of studying the growth of regulatory activity, it was noted that all preparations of the MEE series exceeded the control, but the best result was shown by the preparation MEE-3, a 0.001% solution of MEE-3 increased crop ripening by 98.0%, stem growth by 130.8% and root growth by 146.7% in 6 days.

Ключевые слова: Карбамат, МЭЭ, in silico, in vitro, ДМСО, антибактериальная активность, бактерия, штаммы, гентамицин, биостимулятор, хлопок.

Keywords: Carbamate, MEE, in silico, in vitro, DMSO, antibacterial activity, bacteria, strains, gentamicin, biostimulant, cotton.

Введение. Карбаматы и бис-карбаматы используются в технике вулканизации каучуков, в качестве ускорителей, в производстве полимеров, в получении красок, в производстве смазочных масел и в качестве ингибиторов коррозии [1-2, 5, 11-13]. В области фармацевтики их используют как препараты против различных болезней, а в сельском хозяйстве - как гербициды, пестициды, родентициды, фунгициды, инсектициды, нематоциды, акарициды, бактерициды и биостимуляторы, ускоряющие рост растений [3, 6-7, 9-10]. Продолжая изучение биологической активности N,N'-гексаметилен-бис-[(о-крезолило)-карбамата] т.е. МЭЭ-1 и N,N'-гексаметилен-бис-[(м-крезолило)-карбамата] т.е. МЭЭ-2, а также МЭЭ-3 синтезированных на основе крезолов и диизоцианатов, получили прогнозы в программе PASS online активности для сельскохозяйственных культур. Также препараты серии МЭЭ использовали в качестве регуляторов роста (биостимуляторов) для сельскохозяйственных культур, в том числе хлопка, томата и огурцов [4, 8-9]. Учитывая возможность его применения в сельскохозяйственной отрасли, мы решили изучить in vitro и другие in silico прогнозированные активности.

Материалы и методы исследования. In silico прогнозы активности для сельскохозяйственных культур получены в программе PASS online введением структуры веществ серии МЭЭ-1,2,3. Результаты приняты в интервале наличия активности Pa (0,001-1000). In vitro изучение антибактериальной активности на разных штаммах бактерий, а именно: грамотрицательных бактериях (кишечная палочка) и грамположительных бактериях (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Micrococcus sp.). В качестве контрольного препарата использовали гентамицин. Все соединения растворяли в ДМСО в концентрации 100 мкг/мл. Агаризованные среды и суспензии микроорганизмов готовили по стандартным методикам. Штаммы микроорганизмов помещали в чашки Петри методом «травы». Изучение ростостимулирующей активности проводили по методу Ю.В. Ракитина.[14]. Биотестом служили семена хлопка сорта «С-6524». Препараты растворяли в ДМСО и обрабатывали семена за 18-20 часов перед посевом. Использовали 2 концентрации 0,01 и 0,001%. Опыты повторяли 4 раза. Расчеты проводились путем измерения длины стеблей и корней у 7-дневных сеянцев хлопчатника.

Результаты исследования и их обсуждение. Так как препараты серии МЭЭ являются изомерами, даны результаты только по МЭЭ-1. Наличие прогнозируемой биологической активности вещества МЭЭ-1 для сельскохозяйственных культур приведено в таблице 1.

Таблица 1.

Наличие прогнозируемой биологической активности вещества МЭЭ-1 для сельскохозяйственных культур - Pa (0,001-1000)

По прогнозам таблицы 1, соединение МЭЭ-1 показало наиболее высокий результат - 0,631 (63%) антигельминтной активности в отношении нематод круглых червей. У растений, поврежденных нематодами, наблюдается отмирание корней, повреждение корневищ и образование галлов. Также показан лучший результат - 0,485 (48%) общей антигельминтной активности. Гельминты – паразитические черви, обитающие в растениях и являющиеся возбудителями гельминтозов. Акарицидная активность составила 0,331 (33%). Акарициды – это химические вещества, которые борются с паразитами сельскохозяйственных культур. Противогрибковая активность составила 0,379 (38%). Препараты с противогрибковой активностью уничтожают колонии патогенной флоры. Фунгициды применяют в лечебных и профилактических целях: уничтожают грибы, находящиеся в тканях растений, на поверхности элементов, снижают риск заражения фитопатогенами. По инсектицидной активности он показал результат 0,282 (28%).

Инсектициды – это химические вещества, предназначенные для уничтожения вредных насекомых. 0,512 (51%) показали хорошую активность против пикорнавирусов. Пикорнавирусы размножаются в цитоплазме бактерий и растительных клеток. Суммарная противовирусная активность составила 0,227 (22%). Противовирусное средство непосредственно воздействует на механизмы действия вирусов в зараженном растении и улучшает стрессовое состояние растения. В результате чего, устраняются все негативные причины заражения, и приводит к нормальному плодоношению и нормальной продуктивности. Антисептическая активность не определялась. Противоинфекционная активность показала результат 0,275 (27%). Инфекцией называют взаимодействие чужеродных микроорганизмов с растениями. Антибиотики предотвращают развитие фитопатогенных бактерий и грибов. Антибиотическая активность показала удовлетворительный результат - 0,191 (19%). Антибиотики применяют для профилактики и лечения бактериоза плодовых и декоративных деревьев. Помимо прямого противомикробного действия на возбудителей бактериозов, антибиотические вещества сохраняют в растениях антимикробную активность в течение длительного времени и повышают устойчивость растений к болезням. 0,366 (37%) проявили хорошую антибактериальную активность. Преимуществом бактериальных препаратов является их экологическая чистота, экономичность и мягкое воздействие на растения. Антитоксическая активность показала хороший результат - 0,327 (32%). Антитоксические защитные реакции растений направлены, главным образом, на нейтрализацию ферментов, токсинов и других вредных продуктов жизнедеятельности болезнетворных микроорганизмов. Антидотная активность 0,350 (35%) также показала хороший результат. В основном антидоты способствуют быстрому расщеплению действующих веществ гербицида и ускорению метаболизма в культивируемой растительной клетке.

После получения in silico прогнозируемых данных, исследовали in vitro антибактериальной активности бис-карбаматов серии МЭЭ-1,2,3. Антибактериальную активность бис-карбаматов исследовали на различных штаммах бактерий, а именно: грамотрицательных бактериях (кишечная палочка) и грамположительных бактериях (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Micrococcus sp.). В качестве контрольного препарата использовали гентамицин. «Гентамицин» - антибиотик аминогликозидного ряда, очень активный в отношении аэробных грамотрицательных бактерий. Все соединения растворяли в ДМСО в концентрации 100 мкг/мл, ДМСО также использовали в качестве контроля. Агаризованные среды и суспензии микроорганизмов готовили по стандартным методикам.

Для равномерного распределения клеток микроорганизмов по поверхности среды суспензию микроорганизмов помещали в чашки Петри в стерильной среде методом «травы». Стерильные цилиндры располагали на поверхности среды на расстоянии 2-2,5 см друг от друга и в них вводили по 30 мкл вещества. Посевы инкубировали в термостате при 37 °С в течение 24 часов, после чего измеряли диаметры зоны задержки роста (ДЗЗР). Проявление антимикробной активности отмечали только в том случае, если зона ингибирования составляла более 8 мм. Полученные результаты приведены в таблице 2.

Таблица 2.

Антимикробная активность МЭЭ-1,2,3 (ДЗЗР колоний изучаемых микроорганизмов, мм)

Примечание: * Значительно ниже активности стандартного антибиотика (Дз > 7,4); ** значимо не отличается от стандартного антибиотика (Дз < 2,2; *** значительно превышает активность стандартного антибиотика (Дз > 4,3).

Анализ результатов микробиологических исследований позволили сделать следующие выводы. Установлено, что бис-карбаматы обладают избирательной активностью в отношении изученных штаммов микроорганизмов. Самое удивительное, что карбаматы в орто-положении проявили антибактериальные свойства, и это согласуется с данными литературы об орто-замещенных соединениях. Соединение МЭЭ-1 в штамме Micrococcus sp. показал значительно более высокую активность, чем стандартный антибиотик, но дал значительно меньший результат в остальных случаях. Антибактериальное свойство МЭЭ-1 было предсказано программой PASS с самым высоким Ра-0,366% по сравнению с остальными соединениями. Затем устанавливали минимальные ингибирующие концентрации (МИК) для соединения МЭЭ-1 с использованием серийных разведений (равных 100, 40 и 60 мкг/мл). Хотя препараты МЭЭ-2 и МЭЭ-3 не проявили антибактериальных свойств, учитывая избирательное действие бис-карбаматов, их следует протестировать на других штаммах.

Препараты серии МЭЭ-1,2,3 были in vitro изучены с целью определения их ростостимулирующей активности. Биотестом служили семена хлопка. Первичный скрининг проводили по методу Ю.В. Ракитина. Этот метод позволяет быстро определить уровень физиологической активности химических соединений, который определяется по усилению или торможению всхожести семян растений, а также по изменению длины корня и длины стебля. Вещества испытывали путем замачивания семян в растворах различной концентрации и последующего проращивания их в чашках Петри. Контрольные семена замачивали в дистиллированной воде. В эксперименте использовался среднестебельный хлопок сорта «С-6524». Препараты растворяли в ДМСО и обрабатывали семена за 18-20 часов перед посевом. Использовали 2 концентрации 0,01 и 0,001%. Опыты повторяли 4 раза. Расчеты проводились путем измерения длины стеблей и корней у 7-дневных сеянцев хлопчатника.

Таблица 3.

Влияние препаратов серии МЭЭ на созревание и рост растений хлопчатника

В результате отмечено, что все препараты МЭЭ серии превышают контроль, но самый лучший результат показал препарат МЭЭ-3:   0,001%-ный раствор МЭЭ-3 увеличил созревание урожая на 98,0%, рост стебля на 130,8% и рост корней на 146,7% за 6 дней.

Заключение. При изучении соединения МЭЭ-1 получены прогнозируемые результаты противогельминтной (нематоды) активности - 0,631% и антибактериальной активности - 0,366%. Соединение МЭЭ-1 в штамме Micrococcus sp. показал значительно более высокую активность, чем стандартный антибиотик, но показал меньшую эффективность в остальных случаях. Хотя препараты МЭЭ-2 и МЭЭ-3 не проявили антибактериальных свойств, учитывая избирательное действие бис-карбаматов, их следует протестировать на других штаммах. В результате исследования по рост регулирующей активности отмечено, что все препараты МЭЭ серии превышают контроль, но самый лучший результат показал препарат МЭЭ-3:  0,001%-ный раствор МЭЭ-3 увеличил созревание урожая на 98,0%, рост стебля на 130,8% и рост корней на 146,7% за 6 дней.

Список литературы:

1. Куликова Н. А., Лебедева Г. Ф. Гербициды и экологические аспекты их применения. – М:.  «Либроком», 2010. — 152 с.
2. Клопман Г. Реакционная способность и пути реакций. - М.:Мир,1977. - 341 с.
3. Valentina K. Yu, Praliyev Kaldybay D., Kabdraissova Aissulu Zh., Kanitar Kanitar Synthesis of Biological Active [N-(2-Ethoxyethyl)piperidyl-4]propargyl Derivatives of Natural Alkaloids and Their Synthetic Analogs //2 nd Annual Russian-Korean Conference “Current issues of natural products chemistry and biotechnology”, March 15-18, 2010, Novosibirsk, Russia. -P. 41.
4. Larionov O.V., Kozhushkov S.I., De Meijere Armin. New Protocol for Efficient N -Chlorinations of Amides and Carbamates // J. Synthesis-stuttgart, 2003. -№12. - Pp.1916-1919.
5. Mashayev E., Ismailov B., Ergashev J., Omonov Sh., Makhsumov A.. Research of N,N′-hexamethylene bis-[(o-cresolyl)-carbamate] in international chemicals databases // International bulletin of applied science and technology, 2023, Т. 3, № 11, pp. 397–401. https://doi.org/10.5281/zenodo.10209951
6. Ismailov B.M., Makhsumov A.G., Shomurodov A.I., Valeeva N.G., Kalniyazov I.B. Synthesis Of New Propargyl Ester Derivatives And Biostimulation Activity Of 4-(Bis(2-Hydroxyethyl)Amino)But-2-yn-1-yl Butyrate  // Journal of Pharmaceutical Negative Results. Vol. 14, Regular Issue 03 (2023) – P.2309-2316. SJR 2021 (0.13)) DOI: 10.47750/pnr.2023.14.03.298.
7. Махсумов А.Г., Абсалямова Г.М., Исмаилов Б.М., Машаев Э.Э. Синтез и свойства производного N,N^'_гексаметилен бис-[(орто-аминоацетилфенокси)]-карбамата и его применение // ж: Universum: Химия и биология, элект.научн.ж., Москва, 2019, №3(57). - С.65-72
8. Махсумов А.Г., Машаев Э.Э., Холбоев Ю.Х., Уразов Ф.Б., Зохиджонов С.А. N,N’–гексаметилен бис [(м-крезолило) -карбамат] и его физико-химические свойства // Life Sciences and Agriculture. 2022. №1 (9).
9. Махсумов А.Г., Абдукаримова С.А., Машаев Э.Э., Азаматов У.Р. Синтез и свойства производного - N,N'-гексаметилен бис- [(орто-крезолило) -карбамата] и его применение // Universum: химия и биология. 2020. №10-2 (76).
10. Махсумов А.Г., Жагфаров Ф.Г., Арипджанов О.Ю., Азаматов У.Р. Синтез и свойства производных мета-крезолило-карбаматов, их биологическая активность // НефтеГазоХимия. 2022. №3.
11. Hopkins Thomas R., Stiekler Paul D. Process of produsing 4-hydroxy-2-butynyl N-(3-halophenyl) karbamates //пат.США, кл.260-471, №3155713 – 1965 у.
12. Штамбург В.Г., Клоц Е.А., Сердюк В.Н., Плешкова А.П., Ивонин С.П. Образование N-ацелокси - N-алкоксикарбаматов и N,N¹-диалкоксикарбаматов при нуклеофильном замещении хлора в N-хлор -N-алкоксикарбаматах // Ж. Украин.химия. 2001, №11(67).- С.94-97.
13. Arimitsu Koji, Ishimura Kumihiro. Nonlinear organic reactions of 9-florenylmethyl-carmamates to give branched aliphatic amine compounds and their use of photopolymer systems // J. Master. Chem. 2004, 14, № 3, pp.336-343.
14. Методика Ракитина Ю.В. и Рудник В.Е. – «Первичная биологическая оценка химических соединений в качестве регулятора роста растений и гербицидов» // Методы определения регуляторов роста и гербицидов, Л, Наука 1966г, с.182-197.