БИОДЕГРАДАЦИЯ ХЛОРПИРИФОСА КОНСОРЦИУМОМ МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ПОЧВ УЗБЕКИСТАНА

АННОТАЦИЯ

Из почв Узбекистана, обрабатываемых в течение ряда лет хлорпирифосом и циперметрином, выделено 20 изолятов, способных к росту в присутсвии хлорпирифорса в среде. В результате скрининга культур, выделенных из загрязненных пестицидами почв Узбекистана, отобраны три штамма Pseudomonas sp., Bacillus sp., и Ochrobactrum sp., устойчивых к хлорипирифосу. Лабораторные исследования показали, что полученный консорциум микроорганизмов разлагает хлорпирифос за 28 суток на 91 % при исходной концентрации его в почве 50 мг/кг и на 81,6 % при 100 мг / кг почвы. 

ABSTRACT

From the soils of Uzbekistan, treated for a number of years with chlorpyrifos and cypermethrin, 20 isolates were isolated that capable of growth in the presence of chlorpyrifos in the environment. As a result of screening crops isolated from pesticide-contaminated soils in Uzbekistan, three strains of Pseudomonas sp., Bacillus sp., and Ochrobactrum sp., resistant to chloripyrifos, were selected. Laboratory studies have shown that the resulting consortium of microorganisms decomposes chlorpyrifos in 28 days by 91 % at an initial concentration in soil of 50 mg/kg and by 81.6 % at 100 mg/kg of soil.

Ключевые слова: Pseudomonas sp., Bacillus sp., Ochrobactrum sp., хлорпирифос, бактериальный консорциум, биодеградация.

Keywords: Pseudomonas sp., Bacillus sp., Ochrobactrum sp., chlorpyrifos, bacterial consortium, biodegradation.

Введение. Хлорпирифос − фосфорорганический инсектицид, коммерчески используется с 1960-х годов, особенно для борьбы с вредителями при выращивании хлопка, овощных культур на рисовых полях, пастбищах, и фруктовых садах. После обработки растений или почвы, данный пестицид, находясь в почве, оказывает опасное воздействие на окружающую среду [7]. Массовое применение этого пестицида привело к загрязнению воды и почвы и нарушению биогеохимических циклов [2]. Кроме того, его остатки были обнаружены в различных экологических системах [10]. Выщелачивание применяемого пестицида может привести к загрязнению поверхностных / грунтовых вод, что в конечном итоге приведет к неблагоприятному воздействию на биологические системы [5]. Поэтому очень важно раннее определение и последующая дезинфекция и детоксикация загрязненной окружающей среды. Для детоксикации хлорпирифоса можно применять несколько методов, включая химическую обработку, испарение, фоторазложение и сжигание [6]. Однако вышеизложенные методы дороги, неэффективны и не всегда безопасны для окружающей среды. Альтернативным методом является биоремедиация, которая включает использование потенциала микроорганизмов для детоксикации и разложения загрязнителей. Этот метод заслуживает повышенного внимания как эффективный биотехнологический подход к очистке загрязненной окружающей среды [1]. Использование микробной деградации эффективно и полезно для биоремедиации почв с результатом детоксикации пестицидов, близких концентрациям ниже стандартов установленных как предельно допустимых [9]. Микробное разложение пестицидов было признано наиболее важным процессом, который контролирует их содержание в экологически приемлемых концентрациях [3; 4; 8]. Использование консорциумов, состоящих из различных микроорганизмов, является более эффективным, чем использование одного вида микроорганизмов, т.к. в результате воздействия целого ряда ферментных систем токисканты разлагаются быстрее и эффективнее [8]. 

Материалы и методы

Отбор и характеристика почв. Почва была собрана с глубины 0−15 см с поля фермерского хозяйства Узбекистана, на котором в течение многих лет использовались пестициды − хлорпирифос циперметрин, и другие. В лабораторных условиях перед сушкой почву просеивали через сито из нержавеющей стали диаметром 2 мм с целью удаления тканей и косточек растений и других посторонних включений, после чего почву характеризовали по физико-химическим параметрам. Перед использованием почву стерилизовали автоклавированием в течение 30 мин. при 121 °C.

Образцы и реактивы.  Стандарт хлорпирифоса (чистота 97 %) был получен от Pioneer international Ltd, China. Ацетон хроматографической чистоты и все другие использованные химические реагенты были аналитически чистыми и коммерчески доступными. Исходные растворы хлорпирифоса (0,5 мг/мл; 1 мг/мл; 2 мг/мл) готовили с использованием ацетона в качестве растворителя. В работе использовался pH-метр Metler toledo. Среда МПА, МПБ производства HiMedia Pvt Ltd Mumbai, India. Минеральная солевая среда (MSM) (pH 6,8−7,0).

Хроматографическое определение. Исследование было выполнено на газовом хроматографе Agilent 8890B с испарителями с делением и без деления потока, который использовался вместе с ГХ-МС Agilent серии 5977В в режимах SIM, SCAN и ионизации электронным ударом (ЭУ). 

Результаты и обсуждение

В результате изучения устойчивости микроорганизмов к хлорпирифосу было выделено более 20 изолятов, путем посева на среды, содержащие хлорпирифос. Данные изоляты проявляли ростовую активность при первоначальном посеве. Однако многие изоляты показали в дальнейшем слабый рост и неспособность к размножению при последующих пересевах.  Что может быть связано с токсическим действием хлорпирифоса.  Значительную устойчивость и способность к активному росту при концентрации хлорпирифоса в среде до 100 мг/л показали три изолята № 3, 6, 11, которые были отобраны для дальнейших работ. Были изучены их морфолого-культуральные свойства (Таблица 1). Суточную культуру отобранных изолятов окрашивали по Граму и наблюдали с помощью цветового микроскопа (Model: NLCD-307B) (рис. 1).

Таблица 1.

Некоторые морфолого-культуральные и физиолого-биохимические свойства выделенных культур

Примечание: «-» – наличие/отсутствие признака

изолят № 3                                  изолят № 6                                изолят №11

Рисунок 1. Микрофотографии выделенных штаммов, окрашенных по Граму (ув. 15Х100)

В результате изучения морфолого-культуральных свойств данные изоляты предварительно идентифицированы как: изолят № 3 − Ochrobactrum sp., изолят № 6 − Pseudomonas sp., изолят № 11 − Bacillus sp.

Исследования по биодеградации хлорпирифоса консорциумом микроорганизмов на основе трех выделенных штаммов Ochrobactrum sp., Pseudomonas sp., Bacillus sp. проводились на стерильной почве в лабораторных условиях. После приготовления растворов хлорпирифос (50 и 100 мг/кг почвы) на основе ацетона их добавляли к небольшой части почвы (примерно 20 % из общей массы почвы), после тщательного перемешивания почвы с раствором, смешивали с оставшимся количеством почвы. Затем вносили бактериальный консорциум в концентрации 10⁸ КОЕ/мл. Длительность экспериментов составила 4 недели. Для поддержания влажности (примерно 70 %) почва каждые 3-суток орошалась стерильной дистиллированной водой. Каждую неделю отбирались пробы почв для хроматографического анализа. Содержание хлорпирифоса в почве определялось хроматографически (рисунок 2).

Рисунок 2. Исходное содержание хлорпирифоса в почве

Результаты ГХ-МС анализов показывают, что концентрация хлорпирифоса со временем уменьшается и на 28 сутки снижается до 4,5 мг (при исходной 50 мг/кг), при этом процент деградации хлорпирифоса составил 91 %; и до 18,4 мг (при исходной 100 мг/кг), процент деградации  − 81,6 % (рисунок 3). 

Рисунок 3. Разложение хлорпирифоса бактериальным консорциумом

Полученные данные свидетельствуют об эффективности использования полученного консорциума микроорганизмов Ochrobactrum sp., Pseudomonas sp., Bacillus sp. для деградации хлорпирифоса. Результаты, полученные в лабораторных условиях, показали, что за 28 суток степень разложения при обоих концентрациях составила 86,3 %, что говорит об его высокой эффективности использования для очистки почв, загрязненных хлорпирифосом, кроме того использование данного консорциума микроорганизмов способствует повышению плодородия почвы за счет восстановления чистоты почвы и активизации функционирования полезных микроорганизмов, способствующих повышению плодородия почв. 

Список литературы: 

1. Belal E.B., Zidan N.A., Mahmoud H.A., Eissa F.I. Bioremediation of pesticides-contaminated soils // Journal of Agricultural Research, Kafrelsheikh University. 2008. Vol. 34(3). P. 588 – 608.
2. Chishti Z., Hussain S., Arshad K.R., Khalid A., Arshad M. Microbial degradation of chlorpyrifos in liquid media and soil // Journal of Environmental Management. 2013. Vol. 114. P. 372−380.
3. Eissa F.I., Mahmoud H.A., Zidan N.A., Belal E.B. Microbial, thermal and photodegradation of cadusafos and carbofuran pesticides // Journal of Pest Control and Environmental Sciences. Vol. 14(2). P. 107–130.
4. Karpouzas D.G., Singh B.K. Microbial degradation of organophosphorus xenobiotics: Metabolic pathways and molecular basis. Advances in microbial physiology. 2006. Vol. 51. P. 119−185.
5. Kulkarni A.R., Soppimath K.S., Dave A.M., Mehta M.H. and Aminabhavi T.M. Solubility study of hazardous pesticide (chlorpyrifos) by gas chromatography // Journal of Hazardous Materials. 2000. Vol. 80. P. 9–13.
6. Muhammad S.G. Kinetic studies of catalytic photodegradation of chlorpyrifos insecticide in various natural waters // Arabian Journal of Chemistry. 2010. Vol. 3. P. 127−133.
7. Philip H., Ed. Handbook of Environmental Fate and Exposure Data for Organic Chemicals. 1991. Vol. III. P. 132–144. Lewis Publishers, USA.
8. Sоrensen S.R., Aamand  J., Christian N.A. Rapid mineralization of the phenylurea herbicide diuron by Variovorax sp. strain SRS16 in pure culture and within a two-member consortium // Applied and Environmental Microbiology Journal. 2008. Vol. 74. P. 2332–2340. 
9. Vidali M. Bioremediation. An overview // Pure applied chemistry. 2001. Vol. 73. P. 1163−1172.
10. Xue N., Xu X., Jin Z. Screening 31 endocrine-disrupting pesticides in water and surface sediment samples from Beijing Guanting reservoir // Chemosphere. 2005. Vol. 61. P. 1594–1606.