Экспрессия бета-тубулина-3 в поврежденном нерве при воздействии НПВС

АННОТАЦИЯ

Цель – изучение особенностей восстановления нервных волокон после повреждения в условиях наложения шва нерва с использованием обычного шовного материала и шовного материала с адгезией диклофенака натрия с помощью иммуногистохимических маркеров аксонов.

Материал и методы. Исследована морфология периферического нерва после наложения шва полипропиленовой нитью 8/0 (контроль) и нитью 8/0 с адгезией диклофенака у 15 крыс. Оценивали экспрессию бета-тубулина-3 в разных зонах нерва. Измеряли численную плотность распределения позитивных структур на срезе стандартной площади, из них производили выборку интактных и дегенерирующих (на 7 сутки), регенерирующих и дегенерирующих (на 14 и 28 сутки) волокон.

Результаты. Полученные данные указывают на то, что адгезия на шовный материал НПВС приводит к увеличению количества волокон, прорастающих в дистальный отрезок нерва. Наибольшие различия с контрольной группой отмечаются к концу исследования.

Вывод. Адгезия диклофенака на нить 8/0 при наложении шва нерва приводит к уменьшению выраженности воспаления в зоне шва, что положительно влияет на прорастание нервных волокон.

ABSTRACT

Objective – to study the peculiarities of nerve fiber recovery after damage under conditions of suturing a nerve with the use of conventional suture material and suture material with sodium diclofenac adhesion.

Material and methods. The morphology of the peripheral nerve was studied after suturing with 8/0 polypropylene thread (control) and 8/0 thread with diclofenac adhesion in 15 rats. The expression of beta-tubulin-3 in different zones of the nerve was evaluated. The distribution numerical density of positive structures on the cut standard floor area produced intact and degenerating (7 days), regenerating and degenerating (14 and 28 days) fibers.

Results. The data indicate that adhesion the NSAID to suture material leads to an increase in the number of fibers sprouting in the distal part of the nerve. The greatest differences with the control group are to the observation end.

Conclusion. The Diclofenac adhesion to the 8/0 thread when suturing the nerve leads to a decrease in the inflammation severity in the suture zone, which has a positive effect on the nerve fibers germination.

Ключевые слова: шов нерва, регенерация нерва, кондуит, диклофенак натрия, бета-тубулин-3.

Keywords: nerve suture, nerve regeneration, conduit, sodium diclofenac, beta-tubulin-3.

Известно, что причиной, блокирующей прорастание нервных волокон после оперативного вмешательства на нерве, является воспаление, как ответная реакция на шовный материал. Основной проблемой при восстановлении нерва после травмы является то, что при повреждениях иммунная система запускает каскад процессов, приводящих к формированию рубцовой ткани раньше, чем происходит прорастание нервных волокон, нередко формируются невромы. Одним из способов снижения риска их возникновения является совершенствование шовной техники и методов нейропластики. Кроме того, в тканях мишенях из-за недостаточной трофики после травмирования нерва наблюдаются дистрофические изменения аксона (Валлеровская дегенерация).

Арахидоновая кислота и ее метаболиты (простагландины, лейкотриены), а также ферменты, участвующие в их производстве (циклооксигеназа, липоксигеназа) участвуют в процессе Валлеровской дегенерации и регенерации аксонов (образование конусов роста) [5]. В настоящее время делаются попытки ускорить рост регенерирующих нервных волокон с помощью применения кондуитов – специальных носителей факторов, позволяющих улучшить рост нерва. В данной работе таким кондуитом являлась полипропиленовая нить 8/0 с адгезией молекул нестероидного противовоспалительного средства (НПВС) диклофенак натрия.

Цель работы – изучение особенностей восстановления нервных волокон после повреждения в условиях наложения шва нерва с использованием обычного шовного материала и шовного материала с адгезией диклофенака натрия с помощью иммуногистохимических маркеров аксонов.

Материал и методы. Работа выполнена на 15 половозрелых крысах обоего пола линии Вистар, массой 200-280 гг. Крысы содержались в стандартных условиях вивария. Животных разделяли на интактных (3 крысы), контрольную и экспериментальную группы по 6 крыс в каждой. Всем животным под уретановым наркозом (1 г/кг, внутрибрюшинно) проводили операцию "Микрохирургический шов седалищного нерва конец-в-конец" обычным шовным материалом (полипропилен 8/0) (контрольная группа) и модифицированным (экспериментальная группа) шовным материалом. Модифицированные нити создавались методом поверхностной активации полипропилена (метод «прививки») [4] с адгезией на них молекул диклофенака. Забор объектов исследования – фрагмент нерва с областью шва - осуществляли через 7, 14 и 28 суток после операции, фиксировали в 10% формалине (БиоВитрум). Сроки забора объектов выбирали, исходя из морфологических данных о процессе воспаления (с 1 по 7 день – фаза альтерации; с 14 по 21 день – фаза инфильтрации; с 21 по 28 день – фаза пролиферации). Интактные нервы забирали для оценки изменений в оперированных группах.

Для оценки эффективности регенерации периферических нервов по состоянию осевых цилиндров использовали маркер бета-тубулин-3 [1]. Наибольшая концентрация бета-тубулина наблюдается в растущих периферических нервных проводниках [3]. Бета-тубулин выявляли на парафиновых срезах с помощью моноклональных кроличьих антител (ab6046, UK, 1:250) и вторичных антител (ab97051, UK, 1:1000) с пероксидазной меткой на парафиновых срезах, система детекции DAB SubstrateKit (ab64238). Экспрессия бета-тубулина оценивалась в зоне шва и дистальном участке нерва на продольных срезах. Количественный анализ проводили на изображениях, полученных с помощью светового микроскопа. Для подсчета использовали программу ImageJ (NIH, США). Подсчитывалась численная плотность распределения позитивных структур на срезе стандартной площади (574 мкм²) в 10 полях зрения в каждом случае, из них производилась выборка интактных и дегенерирующих (на 7 сутки), регенерирующих и дегенерирующих (на 14 и 28 сутки) структур. Цифровые данные обрабатывали методами вариационной статистики в программе MS Excel 2010. Различия считались статистически значимыми при уровне р<0,05, что соответствует 95% вероятности безошибочного прогноза.

Результаты исследования и их обсуждение. Полученные в ходе исследования результаты, в целом, согласовались с имеющимися данными о стадийности дегенерации нервных волокон при повреждении, описанные при анализе срезов, окрашенных классическими гистологическими методами, и при электронной микроскопии [2], [6].

Количественные данные участков нерва с экспреcсией бета-тубулина-3 представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Численная плотность бета-тубулин-позитивных волокон в разных зонах нерва в контрольной и экспериментальной группах (х̅ ±s_х̅, шт./мм²)

зоны нерва: прокс– проксимальный отрезок; шов – зона шва; дист – дистальный отрезок. *достоверные различия между группами, ^одостоверные различия с предыдущим сроком.

При оценке состояния проксимального отрезка нерва значимого влияния адгезии НПВС на шовный материал на 7 и 14 сутки не установлено. Отмечена тенденция ускорения дегенерации аксонов в эксперименте. В конце наблюдения численная плотность регенерирующих волокон в контрольной группе достоверно превосходила эксперимент. В зоне шва нерва присутствие НПВС резко снижало воспалительную реакцию и приводило к концу наблюдения к многократному превышению плотности прорастающих волокон по сравнению с контролем. В дистальном отрезке после пересечения и наложения шва нерва происходило набухание осевых цилиндров, образование варикозных расширений, затем аксоны истончались, волокна разрывались. Фрагментация волокон в дистальном участке поврежденного нерва наблюдалась к 7 суткам, при этом в экспериментальной группе она была более выражена. Через 14 суток все аксоны дегенерировали.

Важно отметить, что сроки исследования выбирались, исходя из данных о процессе воспаления. «Решающая» фаза приходится на 14-28 сутки, когда в зону шва устремляются лимфоциты. Пролиферация фибробластов в эпиневрии, периневрии или эндоневрии может привести к рубцу. Он образует механический барьер для регенерирующих аксонов, вызывает усадку эндоневральных оболочек, содержащих аксоны, и способствует развитию множественных разветвленных аксональных терминалов с образованием невромы [6]. На провоспалительные цитокины, вырабатываемыми лимфоцитами, и действует НПВС, что объясняет уменьшение выраженности рубца и эффективное прорастание волокон в дистальный участок нерва.

Вывод. Таким образом, проведенное исследование доказывает эффективность использования модифицированной нити для микрохирургического шва нерва.

Список литературы:
1. Коржевский Д.Э., Кирик О.В., Карпенко М.Н. Теоретические основы и практическое применение методов иммуногистохимии: руководство. – 2-е изд., испр. и доп. – СПб: СпецЛит, 2014. – 119 с.
2. Ноздрачев А.Д., Чумасов Е.И. Периферическая нервная система. Структура, развитие, трансплантация и регенерация – М.: Наука, 1999. – 272 с.
3. Петрова Е.С., Павлова Н.В., Коржевский Д.Э. Современные морфологические подходы к изучению регенерации периферических нервных проводников // Медицинский академический журнал. – 2012. – Т.12. №3. – С.15-23.
4. Староверов И.Н., Ильин М.В., Русаков А.И., Зотов А.С., Орлов В.Ю. Патент на изобретение RU 2549456 «Хирургический материал терапевтического действия», ЯрГУ им. П.Г. Демидова.
5. Щаницын И.Н., Иванов А.Н., Бажанов С.П., Нинель В.Г., Пучиньян Д.М., Норкин И.А. Стимуляция регенерации периферического нерва: современное состояние и перспективы // Успехи физиологических наук. – 2017. – Т.48. №3. – С.92-112.
6. Gaudet A.D., Popovich Ph.G., Ramer M.S. Wallerian degeneration: Gaining perspective on inflammatory events after peripheral nerve injury // Journal of Neuroinflammation. – 2011. – P.1-13. DOI: 10.1186/1742-2094-8-110.