ТЕХНОЛОГИЯ НЕТРАДИЦИОННОГО СБАЛАНСИРОВАННОГО КОМБИКОРМА, С ОБОГАЩЕННЫМ БЕЛКОМ И ФЕРМЕНТАМИ СОСТАВОМ ИЗ ГРИБКА Pleurotus ostreatus

АННОТАЦИЯ

Настоящая статья посвящена изучению особенностей синтеза белка, выбранного базидиального гриба-продуцента Pleurotus ostreatus с использованием микробиологических методов для увеличения количества белка в кормах при приготовлении сбалансированных, богатых белками комбикормов, используемых в рыбном хозяйстве.

ABSTRACT

This article is devoted to the study of the protein synthesis characteristics of the selected basidial fungus Pleurotus ostreatus producer, using microbiological methods to increase the protein content of the feed in the preparation of balanced, protein-rich, mixed feed used in fisheries.

Ключевые слова: Pleurotus ostreatus, сбалансированный корм, белок, ферментативная активность, амилаза, протеаза, базидиальный гриб, ростовые показатели, белок, среда, биомасса.

Keywords: Pleurotus ostreatus, balanced feed, protein, enzymatic activity, amylase, protease, basidiomycetes, growth indicators, protein, environment, biomass.

Введение. В процессе развития основной отрасли важную роль играет уровень производства вспомогательной продукции, способный обеспечить ее на практике и провести параллельно исследовательскую деятельность, предоставив тем самым количество и качество белковой продукции – животноводческой, птицеводческой и рыбной. При этом необходимо обеспечить требования пищевой безопасности согласно принятых Правительством программных мер. Рыбное хозяйство развивается на основе предпринимательства в тыс га созданных вновь искусственных водоёмах.

Основным фактором повышения продуктивности рыбного хозяйства является рациональное кормление. Данная ситуация является актуальной научной проблемой [8; 9].

Эффективность кормления рыб зависит от правильности рецептуры корма: белки, жиры, углеводы должны быть подобраны по нормативам. Разумеется, количество витаминов, минералов, гормонов, органических кислот и биологически активных веществ должно основываться на потребностях рыбьего организма. Однако с точки зрения питания объекты аквакультуры кормятся совсем иначе, чем другие сельскохозяйственные животные, и даже пищевые потребности разных рыб различны. Корм для рыб может быть простым или сложным в зависимости от количества содержащихся в нем питательных веществ. Сегодняшние корма содержат в своем составе больше компонентов, богатых углеводами, таких как дробленое зерно, отруби мукомольной промышленности, рисовый порошок, а также масла и жиры. Также добавляется небольшое количество пищевых отходов общественного питания, пшенично-ячменных отходов производства пива и вина. Суть в том, что в настоящее время при разработке кормов используются богатые углеводами местные продукты питания, к ним добавляются витаминные комплексы (премиксы) и источник необходимых минералов (костный порошок). Естественно, основную часть состава корма составляют углеводы, а количество белка составляет до 19–20 %. По требованию рыбной промышленности содержание протеина в кормах должно быть выше 32 %. В результате этих анализов и формируется основная цель и задачи данного исследования [17].

Состояние проблемы. Корма, используемые в рыбном хозяйстве, делятся на: натуральные, дополнительные и сбалансированные. Природные пищевые ресурсы включают в себя: фитопланктон, зоопланктон, микроскопические водоросли, верхние и придонные растения, зообентос, нектобентос и водные насекомые. Дополнительные питательные вещества имеют в своем составе растительные культуры и остатки, переработанные побочные продукты животного происхождения и пищевые отходы. К сбалансированным кормам относятся комбикорма с очень высоким уровнем питательности, пищевая единица которых составляет 1,5–2,0 [6; 14].

Для получения кормового и пищевого белка можно ис­пользовать различные виды низших и высших грибов, выращенных промышленным способом. Некоторые виды микроскопических грибов способны накапливать до 50 % белка. По содержанию незаменимых аминокислот белок грибов приближается к белку животного происхождения, биомасса богата витаминами, особенно, группы В, содержание нуклеиновых кислот низ­кое (2,5 %), клеточные стенки тонкие и легко перевариваются в же­лудочно-кишечном тракте животных. При выращивании микроскопических грибов в жидкой питательной среде, как правило, на первой стадии культивирования про­исходит интенсивное образование биомассы. В условиях глубинного культивирования в течение первых 5–6 часов происходят сложные внутриклеточ­ные преобразования в конидиях: они набухают, и появляются первые гифы. Далее идет быстрое развитие и рост мицелиальной массы гри­ба. Мицелий может формироваться в виде шариков или кашеобраз­ной массы [4; 5; 7].

Ферменты катализируют миллионы химических превращений в клетках животных, растений, микроорганизмов и воздействуют на соответствующие субстраты вне клеток. Достоинством применения ферментов перед химическими катализаторами является то, что они действуют при нормальном давлении, в диапазоне температур от 20 до 70^оС, рН от 4 до 9, в большинстве случаев имеют высокую суб­стратную специфичность, что позволяет в сложной смеси биополи­меров направленно воздействовать на определенные соединения.

Следует различать два понятия: ферменты и ферментные препа­раты. Ферменты находятся практически во всех живых объектах: рас­тениях, животных и микроорганизмах [1].

Для достижения роста белков в комбикормах используют штаммы грибов Pleurotus Ostreatus широко культивирующихся во всем мире, обычно в Азии, Америке и Европе, из-за их простоты, низкой стоимости технологии производства и высокой биологической эффективности. Для роста вешенки необходимы высокая влажность (80–90 %) и температура 25–30°С для формирования плодового тела. Отработанный субстрат, оставшийся после сбора урожая, можно использовать в качестве кондиционера почвы для растений и корма для животных после выращивания грибов. Субстраты, которые использовались для производства грибов в предыдущих исследованиях, включают в себя рисовую солому, рисовые отруби, пшеничную солому, мякоть, кукурузные початки, отходы какавеллы, хлопковые отходы, дробину, опилки, кукурузную шелуху и кожуру маниоки. Другими субстратами являются соевая солома, рисовая солома, стебли подсолнечника, жом сахарного тростника, фруктовые отходы, использованные чайные листья, листья бамбука и стебли кукурузы. Дополнительными субстратами, используемыми для выращивания вешенок, являются отходы энсета, солома тефа, бумажные отходы, шелуха пальчатого проса и псевдостебли бананов. Таким образом, настоящее исследование направлено на оценку культивирования Pleurotus ostreatus как на различных субстратах, так и на их комбинациях [2].

Экспериментальная часть

Научные исследования проводились в лаборатории «Биотехнология охраны природы» института Микробиологии АН Республики Узбекистан. С использованием некоторых непатогенных культур грибов, проявляющих способность синтезировать активные белки, хранящихся в музее культур этой лаборатории, были проведены синтетические работы по получению смешанных питательных, богатых белком кормов для рыбоводства. На богатой питательной среде, выращивали базидиальный гриб Pleurotus ostreatus (гриб обыкновенный-вещенка обычная), относящийся к классу базидиомицетов, и определяли количество образующихся в культуральной жидкости белков, активность ферментов и ростовые показатели (индекс pН среды, накопление биомассы) [11].

Методика проведения экспериментов. В данном случае белки культуральной жидкости определяли классическим методом – методом Лоури. Количество белка определяли по калибровочной кривой, построенной с использованием бычьего сывороточного альбумина. Для анализа к 2 мл реагента С добавляют 0,4 мл фильтрата и выдерживают при комнатной температуре 10 мин. Затем добавляют 0,2 мл реактива Фолина и оставляют смесь на 30 мин. для изменения цвета. При этом смесь в эксперименте медленно меняет цвет с желтого на голубой прозрачный. Оптическую плотность определяют в ФЭК на длине волны 750 нм.

Амилолитические ферменты (α-амилаза) в культуральной жидкости, активность которых определяют гидролизом 1,0 % крахмального клейстера, активность фермента α-амилазы определяют путем измерения распада крахмального субстрата на различные низкомолекулярные декстрины и сахара, а также ферментную единицу, добавляют 1 мл культуральной жидкости, на 10 мин определяют мг декстрина или малых сахаров.

Процесс ферментации проводили в течение 10 мин. при температуре 30°С и кислотности среды рN ̴ 6,5. Для этого к 2,0 мл 1 % крахмала добавляли 1 мл культуральной жидкости, тщательно перемешивали и инкубировали на водяной бане при температуре 30°С в течение 10 мин. Такое же количество (1 мл) дистиллированной воды поместили на крахмал в контрольной пробирке. По окончании времени реакции отбирали аликвоту объемом 0,5 мл, добавляли рабочий раствор йода и хорошо перемешивали. При этом пробирки были разного цвета, например, контрольные пробирки были сине-воздушными, а в опытных пробирках активность фермента менялась на пурпурную, темно-красную, коричневую и желтую в зависимости от уровня разложения крахмала. После согласования цветов в течение 10 мин. измеряли оптическую плотность реакционной жидкости методом ФЭК на длине волны 670 нм.

Протеолитическую ферментативную активность культуральной жидкости определяли методом Ансона. Этот метод основан на расщеплении и идентификации казеината натрия до пептида или аминокислоты с помощью ферментного препарата. Для проведения эксперимента 1 см³ субстрата (казеинат натрия) помещают в пробирки и помещают в термостат при температуре 30°С. Примерно через 10 мин. в каждую пробирку добавляли по 1 см³ культуральной жидкости и инкубировали на водяной бане при 30°С в течение 10 минут. После окончания процесса брожения пробирки охлаждали и вливали в них по 2 см³ 0,3 М трихлоруксусной кислоты, эта смесь способствует остановке реакции и осаждению белка и высокомолекулярных продуктов гидролиза. Смесь быстро перемешать и инкубировать на водяной бане при температуре 30°С в течение 20 мин. для быстрого осаждения. Затем смесь фильтруют в сухие пробирки. Фильтрат должен быть очень прозрачным. Затем в пробирки добавляют 5 см³ 0,5 моль/дм³ раствора карбоната натрия и 1 см³ фильтрата. Их хорошо перемешивают и помещают в фольгу с реагентом объемом 1 см³. Пептиды и аминокислоты гидролизованного белка окрашивают с помощью реагента фолина и сравнивают интенсивность окраски с контрольной трубкой оптической плотности на длине волны 670 нм с помощью ФЭК [3; 11].

Количество биомассы, образуемой грибом в процессе роста и развития, определяют путем фильтрования культуральной жидкости гриба, высушивания его оставшихся клеток на фильтровальной бумаге при комнатной температуре и измерения их на аналитических весах.

Результаты и их анализ

Сегодня, в связи с резким ростом населения в Узбекистане, массовое производство продуктов питания становится актуальным вопросом. Мясо и мясопродукты составляют значительную часть продуктов питания, потребляемых населением.

Поскольку производство продуктов из мяса животных требует длительного периода времени, развитие птицеводства и рыболовства в последнее время становится все более традиционным, что позволяет удовлетворить потребность населения в мясе и продуктах, богатых белком.

Цель наших исследований – создание биотехнологий на основе микробиологических исследований и решение отраслевых задач по производству сбалансированных высокобелковых кормов для рыб на основе местного сырья, способных конкурировать с зарубежными комбикормами.

В ходе научных исследований мы культивировали местный базидиальный гриб Pleurotus ostreatus (гриб обыкновенный) на некоторых сельскохозяйственных вторичных материалах, растительных остатках, богатых целлюлозой (отруби, опилки, солома и т.д.) и за счет ферментационного процесса роста этим грибом изучены случаи повышения пищевой ценности кормовой продукции за счет увеличения количества вырабатываемого белка [13].

С целью повышения белковости корма для рыб изучали динамику увеличения количества белка в корме по сравнению с контрольным кормом при выращивании белоксинтезирующих и базидиальных грибов (рис.1).

Рисунок 1. Динамика накопления белков посредством грибов

Из рисунка 1 следует, что количество монадного белка увеличивалось с 4,6 мг/мл через 72 часа до 17,5 мг/мл к 168 часам. Затем, до 240 часов, количество белка снижалось до 7,5 мг/мл.

Рисунок 2. Параметры роста, pH и биомасса гриба Pleurotus ostreatus

На рисунке 2 приведены показатели роста гриба Pleurotus ostreatus, то есть сдвиг показателя рН среды от нейтральной 5,9–6,0 в кислую сторону 4,0 в зависимости от влияния ростовых факторов количества биомасса, продуцируемая в среде, 5,2 г – через 72 часа с 168 часов до 6,8 г.

Рисунок 3. Параметры роста, активность гидротических ферментов гриба Pleurotus ostreatus

Изучена активность грибных амилолитических ферментов (рис. 3), образующихся в культуральной жидкости при разложении углеводов, присутствующих в культуральной среде, показывающая наибольшую величину в 27, 4-41 ед./мл при 144–168 часах роста. В динамике роста можно наблюдать образование протеолитических ферментов при разложении белков, образующихся в окружающей среде за счет роста грибов и накопления биомассы. Протеазная активность, продуцируемая во время ферментации, показала максимальную величину 6,2 ед/мл через 168 часов роста [12; 15; 16].

На основании наших исследований можно сделать вывод о том, что Pleurotus ostreatus возможно использовать в качестве базидиального гриба-продуцента, продуцирующего большое количество белка за короткий период времени, при налаживании производства рыбных кормов со сбалансированным белком, быстро и легкоусвояемым.

Список литературы:

1. Гореликова Г.А. Основы современной пищевой биотехнологии: учеб. пособие. – Кемерово: Кемеровский технологический институт пищевой промышленности, 2004. – 100 с.
2. ГОСТ 20264.2-88 Препараты ферментные. Методы определения протеолитической активность. – 15 с.
3. ГОСТ 20264.4-89 Группа С09 Межгосударственный стандарт препараты ферментные Методы определения амилолитической активности. – 27 с.
4. Ерёмина И.А., Лузина Н.И., Кригер О.В. Микробиология продуктов растительного происхождения: учеб. пособие. – Кемерово, 2003. – 94 с.
5. Закирова М.Р. Усовершенствование технологии применения протеиназ при переработке крахмалистого сырья: автореф. дисс. канд. тех. наук. – Ташкент, 2009. – 44 с.
6. Ниёзов Х.Н., Додаев К.О. Балиқ учун яратилган озуқа-ем таркибидаги оқсил миқдорини аниқлаш / Ёш олимлар, магиcтрантлар ва бакалавриат талабаларини ХХХII-илмий-техникавий анжуманининг мақолалар тўплами. “Умидли кимёгарлар-2023” . Тошкент.   – Б. 467–469.
7. Ниёзов Х.Н., Додаев Қ.О., Ахмедова З.Р. Балиқлар учун озуқа ем културасида “Aspergillus oryzae” ва “Pleurotus ostreautus” замбуруғларни экиш орқали оқсил миқдорини ошириш. “Sentrial asian food engineering and technology” // Электрон илмий журнал. Узбекистан. – 2024. – № 3. – б. 40-46. 
8. Саковская В.Г., Ворошилина З.П., Сыров В.С. Практикум по прудовому рыбоводству”. – Москва: ВО “Агропромиздат” 2010. – 174 с.
9. Холмирзаев D., Ҳақбердиев P.S., Шохимардонов D.Р., Шаптаков E.С. Балиқчилик асослари. – Тошкент: Илм-Зиё, 2016.
10. Adenipekun C.O., Omolaso P.O. Comparative study on cultivation, yield performance and proximate composition of Pleurotus pulmonarius Fries. (Quelet) on rice straw and banana leaves // World Journal of Agricultural Science. – № 11(3). – 2015. – Р.151–158.  
11. Batt C.A., Tortorello M.L. Encyclopedia of Food Microbiology. –Academic Press, 2014. – 287 р.
12. Campbell, D.J., Stothers, S., Vaisey, M. and Berck, B. Gamma irradiation influence on the storage and nutritional quality of mushrooms // Journal of Food Science. – 1968. – № 33. – Р. 540–542.
13. Iwase K., Umezawa Y., Masuda K. Cultivation of Pleurotus ostreatus with beer spent grains and utilization // Mushroom Science – 2000. – Vol. 15(2). – Р. 819–826.
14. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent // Journal of Biological Chemistry. – 1951. – Vol. 193(1). – P. 265–275.
15. Moonmoon M.M., Uddin N.S., Ahmed N.J., Khan M.A. 2010. Cultivation of different strains of king oyster mushroom (Pleurotus eryngii) on saw dust and rice straw in Bangladesh // Saudi Journal of Biological Science. – 2010. – 17. – Р. 341–345.
16. Negi S., Banerjee R. Characterization of amylase and protease produced by Aspergillus awamori in a single bioreactor // Food Research International. – 2009. – Vol. 42. – Is. 4. – P. 443–448.
17. Pulatov I.B.,  Zhuraeva K.M., Dodaev K.O.,  Niyozov Kh.N.  Safety study of Uzbekistan freshwater fish and their canned fish // Вестник Казахского университета технологии и бизнеса. – Астана. – № 2. –2023. – С. 68–74.