Полипренолы листьев Vitis vinifera L. и их влияние на активность протеазы кишечника крыс в постнатальном онтогенезе

Введение

Виноград –Vitis vinifera L. семейства. Vitaceae – культивируется на Кавказе, в Украине, Молдове, Крыму и в Средней Азии [5, с. 60; 6, с. 7]. К европейско-азиатской группе относят один вид: Vitis vinifera L., который включает в себя подвиды Vitis vinifera subsp. sativa (виноград культурный) и различные культурные сорта, а также Vitis vinifera subsp. silvestris (виноград лесной). Вид Vitis vinifera L. делится на 3 эколого-географические группы. Восточная группа Vitis vinifera сonvar. orientalis Negr включает более 44 мало изученных сортов [6, с. 7; 3, с. 6].

Ранее нами были изучены полипренолы листьев белого винограда Vitis vinifera L. сорта «Буваки» и дикого винограда Vitis vinifera subsp. silvestris произрастающего в Сурхандарьинской области, а также их гепатопротекторная активность их [8, с. 371; 15, с. 97].

Известно, что полипренолы обладают разно­образной биологической активностью, среди которой особый интерес представляет гепатопротекторная активность и способность стимулировать регенераторные процессы в организме [13, с. 107; 11, с. 4]. Изучена коррекция морфофункционального состояния печени при ожирении с препаратом ропрен на основе полипренолов хвойных пород. В результате показано, что включение в корм ропрена способствовало улучшению морфофункциональных показателей ожирения и нормализовало массу тела животных [9, с. 225].

На сегодняшний день в мире профилактика и поиск мер лечения патологических состояний, возникающих в пищеварительной системе в результате распространения солей тяжёлых металлов, является одной из актуальных проблем, стоящая перед биологами, экологами и сотрудниками здравоохранения. Согласно проводимым исследованиям, ежегодно в среднем свыше 400 тыс. тонн свинца в качестве техногенного металла выделяется в окружающую среду [10, с. 45]. Как известно, пищеварительная система, являясь первоначальным связывающим звеном между окружающей средой и организмом, подвергается воздействию раздражителя. Хроническое отрав-ление свинцом приводит к нефриту, анемии, параличу [4, с. 29; 1, с. 13]. Для лечения свинцовой интоксикации биологически активные соединения растительного происхождения являются перспек­тивными источниками при создании эффективных фармакологических препаратов [2, с. 8].

Исходя из вышеизложенного исследование кишечного пищеварения при воздействие ионов свинца и поиск соответствующих корригирующих соединений, несомненно, является актуальным направлением физиологических исследований.

Целью данного исследования является изучение полипренолов листьев дикого красного винограда Vitis vinifera subsp. Silvestris, произрастающего в Ташкентской области и его действия на коррекцию кишечных протеаз тонкой кишки крыс в постнатальном онтогенезе при воздействии хлорида свинца.

Методика исследования.

Выделение суммы экстрактивных веществ. Листья дикого красного винограда (100 г), собранной в Ташкентской области Паркентского района (2014 г.) измельчали до степени помола 2,0-3,0 мм. Экстрагировали трехкратно 96%-ным этиловым спиртом при гидромодуле 1:20(1:8, 1:6, 1:6) методом ультразвукового перемешивания. Все спиртовые экстракты объединяли, растворитель отгоняли на роторном испарителе при 40⁰С. В результате получили сумму экстрактивных веществ (СЭВ) в количестве 13,54г (13,54% от ВСМ).

Выделение полипренолов из СЭВ. Сумму СЭВ (13,54г) разделяли на колонке. Колонка диаметром 3,0х135 см; в качестве адсорбента использовали силикагель КСК 100/250 меш, соотношение адсорбента к экстракту 15:1, элюент петролейный эфир: этилацетат 100:1. Были собраны 72 фракций по 10 мл. Фракции 42-65, содержащие полипренолы, объединяли. Выход 2,56 г (18,9 % от суммы экстрактивных веществ) с содержанием ПП 96,8% по ВЭЖХ. Выход фракции 66-72 был 0,61 г (с содержанием ПП- 33,3%). Общий выход ПП 2,76 от ВСМ. Полипренолы листьев Vitis viniferaL. представляли собой светло-желтое масло. МС ИЭРПИ: C₅₀H₈₂O -721 (М+nNa); C₅₅H₉₀O -789 (М+nNa); C₆₀H₉₈O, 857 (М+ nNa).

Определение гомологического состава полипренолов проводили на хроматографе Agilent Technologies -1100 на колонке 0.46х150 мм Eclipse XDB-C-18. Подвижная фаза: градиентная 0-20 мин 0-75% В; 20-25 мин 75-100%В; 25-30 мин 100-0%В, скорость потока 0.75 мл/мин, время анализа 30 мин. Cистема А - смесь метанол - вода 9:1(v/v), В - метанол-гексан-изо-пропанол - 2:1:1. Профиль хроматографии снимали при 210 нм.

Определение активности протеаз кишечника проводили по методике [12, с. 20].

Результаты исследования и их обсуждения. Полипренолы листьев винограда Vitis vinifera subsp. silvestris выделяли разделением на колонке сумму экстрактивных веществ полученной экстракцией сырья 96%-ным этиловым спиртом ультразвуковом перемешивание. Выход полипренольной фракции составил 2,56 г с содержанием полипренолов 96,8%. Определение гомологического состава полипренолов проводили на хроматографе Agilent Technologies-1100. Количество пренолов определяли относительно хроматограммы стандартного образца по соотношению площадей пиков с помощью программы Agilent Chemstation. В качестве стандарта использовали полипренолы листьев - Rhus coraria [14, с. 832]. Полученные данные приведены в табл. 1.

Таблица 1.

Гомологический состав полипренолов, % от веса фракции

Результаты анализа показали что, домини­рующими являются ундекапренол и додекапренол содержаниям 48,8% (n=11) и 44,4% (n=12), а содержание декапренола составляет лишь 6,8% (n=10).

Идентификацию полипренолов дикого винограда проводили с применением ИК-, ¹Н С ЯМР–спектроскопии и масс-спектрометрии.

В ИК- спектре (ν,см^-1) полипренолов имеются следующие характерные полосы поглощения: 3534 -свободная гидроксильная группа, 2924 ^–С-Н СН₂, СН₃-группы, 2854 -С-Н СН₂-, 1667 -С=С-, 1449 -СН₃, СН₂ групп_, 1377 -С-Н СН₃- группы, 1000- С-O (СН=СН-СН₂-ОН), 835- С-Н (СН₂-С(СН₃)=СН-СН₂) фрагмента.

В ¹Н ЯМР-спектре имеются синглетные сигналы при 1,66 и 1,48 м.д. цис- и транс-метильных групп –СН₂-С(СН₃)-СН- в соотношении 2:1; мультиплет в области 1,76-2,125 м.д. характеризует метиленовые протоны изопреноидной цепи; дублет c центром 4,14 м.д.(J= 7,5 Гц) –метиленовые протоны концевого звена –СН-СН₂ОН; уширеный синглет при 5,12 м.д. относится к олефиновым протонам середины цепи и триплет с центром 5,35 (J=7,2Гц) - к олефиновому протону концевого звена. Спектральные характеристики полипренолов соответствуют литературным данным [7, с. 328; 8, с. 374].

Влияние полипренолов винограда на активность протеаз кишечника были изучены в биофаке национального университета республики Узбекистан. Подопытные животные были разделены на три группы– первая группа контрольная, не подвергающая воздействию хлорида свинца, вторая опытная группа получила хлорид свинца (0,5 мг/кг), третья группа получала эту же дозу и полипренолы по 0,5 мг/кг. Каждая группа состояла из растущих, зрелых и старых крыс. В результате интоксикации хлоридом свинца активность фермента протеазы кишечника различных возрастных групп снизились на 47,6±3,4%, 41,9±3,1% и 34,7±3,3% соответ­ственно. У растущей группы животных применение полипренола способствовала восстанавлению активности фермента на 20,9±0,3%, у зрелых крыс на 16,1±1,6%, у старых крыс на 14,5±0,1% (Рис 1).

Следовательно, выше перечисленные сведения свидетельствуют о том, что полипренолы листьев Vitis vinifera L. способствуют увеличению активности фермента протеазы в слизистой оболочке кишечника, сниженной под влиянием хлорида свинца.

Рисунок 1. Влияние полипренолов на активность протеазы тонкой кишки в результате интоксикации хлорида свинца. (n=8). Контроль, PbCl₂ (5,0 мг/кг), PbCl₂ (5,0 мг/кг)+полипренол (5,0 мг/кг).
* Степень достоверности по сравнению с контролем * - Р<0,05; ** - Р<0,01; *** Р<0,001

Результаты диаграммы 1 показывает, что восстановление активности протеазы репрессивно связано с возрастом, и у растущих сильно выражается по сравнению со старыми и половозрелыми крысами.

Выводы. В результате исследования листьев дикого винограда Vitis vinifera S. silvestris установлен гомологический состав полипренолов с приме­нением ВЭЖХ и составляют 6,8% (n=10), 48,8% (n=11), 44,4% (n=12). Изучено корригирующее действие полипренолов растений Vitis vinifera S. silvestris на активность протеазы кишечника при интоксикации хлоридом свинца. Показано, что у растущей группы животных применение поли­пренола способствовала восстанавлению активности фермента на 20,9±0,3%, у зрелых крыс на 16,1±1,6%, у старых крыс на 14,5±0,1%.