Стандартизация надземной части Aconitum zeravschanicum в качестве алкалоидоносного сырья

Введение.

Растение борец (или аконит) зеравшанский (Aconitum zeravschanicum Worosch., сем. Ranunculaceae) произрастает на каменистых альпийских лугах в высокогорной области, в арчевых рощах (2710- 3070 м), вид является Памиро-Алайским эндемом. Многолетнее травянистое растение. Стебли высотой 20- 100 см, прямые, простые, округлые. Листья в числе 4-10, на длинных (8- 15 см) голых черешках; пластинка голая, в очертании круглая. Цветет в июле, плодоносит в августе [1]. Растение является алкалоидоносом, алкалоиды в котором относятся к классу дитерпеновых.

Из данного растения выделены алкалоиды тангутизин, зераконин, атизин-хлорид, изоатизин, гетизин, номинин, зеравшанизин, бензоилгете­ратизин, атидин, гетератизин, атизин-азометин и др. [4]. Содержание суммы алкалоидов в сырье колеблется от 1,6% до 3,0%, содержание алкалоида атизина (из которого получают дигидроатизин) – от 0,4% до 0,6% от массы воздушно-сухого сырья [3].

Проведенные сотрудниками (Джахангиров Ф.Н. и др.) отдела фармакологии и токсикологии Института химии растительных веществ Академии наук Республики Узбекистан исследования по изучению алкалоидов и их производных, выде­ленных из настоящего растения, показали, что все объекты исследований выявили противоаритмическую активность на разных уровнях. Наиболее высокая противоаритмическая активность проявлена дигидроатизином, который получен путем восстановления атизина [2].

Исходя из вышеизложенного, нами предлагается вести стандартизацию растительного сырья по целевому алкалоиду – атизину.

Целью настоящей работы является разработка методики качественного и количественного определения атизина в надземной части Aconitum zeravschanicum.

Полученные научные результаты и их обсуждение.

Для экспериментов использовали свежесоб­ранные растения, произрастающие в Зеравшанской долине (Джизакская область, Республика Узбекистан). До появления бутонов собрали органы надземной части растения (стебли, черешки, листья и цветонос), порезали мелкими кусками по 5- 10 см. Влажное сырье сушили на открытом воздухе, при этом избегая прямого попадания солнечных лучей.

Сырье для переработки представляет собой смесь кусочков стеблей, черешков и пластинок листьев травы. Кусочки стеблей и черешков листьев ребристые, опушенные, стебли полые от 3 до 10 см длины, 0,8 мм толщины. Кусочки листьев различной формы от 2 до 6 см, плотные. Цвет стеблей, черешков и листьев от светло-зеленого до темно-зеленовато-бурого. Имеет слабый запах.

В готовом сырье отсутствуют минеральные и органические примеси. Числовые показатели сырья изучали по общепринятым методикам (ГФ XI).

Выделение суммы алкалоидов для проведения качественных реакций. Аналитическую пробу измельченного сырья навеской в 10 г смачивали 5% раствором натрия карбоната, затем экстрагировали хлороформом в соотношении 1:100 при кипячении на водяной бане с обратным холодильником в течение 1 ч. За это время достигается полное извлечение суммы алкалоидов из сырья. Хлороформное извлечение суммы алкалоидов выпаривали досуха. Сухой остаток растворяли в 2 мл хлороформа. Полученный раствор использовали для проведения качественных реакций.

Качественные реакции. 1. Исходя из алка­лоидного состава объекта, следует проводить реакцию на алкалоиды. Для этого к 1 мл хлороформного раствора суммы алкалоидов, полученного вышеизложенным методом, прибавляли 2 мл 5% раствора кислоты серной, слегка встряхивали, прибавляли 2-3 капли раствора кислоты кремневольфрамовой – выпадал желтовато-белый осадок (алкалоиды).

2. На линию старта пластинки «Merck» F₂₅₄ (10×15 см) полосой длиной 2,5 см микропипеткой наносили 0,05 мл хлороформного раствора суммы алкалоидов. Рядом в качестве свидетеля наносили длиной 2,5 см 0,03 мл спиртового раствора алкалоида атизин-хлорида. Пластинку с нанесенными пробами высушивали на воздухе до удаления запаха растворителей в течение 10-15 мин. и помещали в ненасыщенную камеру с системой растворителей хлороформ-бензол-диэтиламин в соотношении 10:40:3 и хроматографировали восходящим способом.

Когда фронт растворителей доходил до конца пластинки, ее вынимали из камеры и высушивали на воздухе до удаления запаха растворителей в течение 20-30 мин. Пластинку рассматривали в УФ-свете (254-нм). На хроматограмме из суммы наблюдали проявление 10 пятен в виде полос, на уровне из точки свидетеля проявилось пятно атизина-хлорида.

Выделение суммы алкалоидов для проведения количественного определения. Аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 5 мм. Пробу точной навеской в 20 г измельченного сырья помещали в фарфоровую чашку, смачивали 20 мл 5% раствора натрия карбоната, перемешивали, остав­ляли стоять в течение 60 мин. Затем количественно переносили в бумажный патрон, который помещали в аппарат Сокслета, и исчерпывающе извлекали алкалоиды хлороформом на водяной бане в течение 5 часов (объем раствора 350 мл, 20 сливов) до отрицательной реакции с кислотой кремневольфрамовой. Хлороформное извлечение собирали в колбу вместимостью 500 мл, упаривали на водяной бане до объема около 25 мл, количественно переносили в делительную воронку вместимостью 200 мл, и алкалоиды последовательно извлекали 20, 15, 15, 10 мл 5% раствора кислоты серной до отрицательной реакции с кислотой кремневольфрамовой. Сернокислое извлечение подщелачивали 20% раствором натрия карбоната до рН 9-10, и алкалоиды извлекали последовательно 20, 15, 15 и 10 мл хлороформа до отрицательной реакции с кислотой кремневольфрамовой. К объединенному хлороформному извлечению прибавляли 5 г натрия сульфата безводного, встряхивали и фильтровали через бумажный фильтр, предварительно смоченный хлороформом, в колбу для отгонки. Фильтр промывали 4 раза хлороформом порциями по 5 мл и присоединяли их к основному извлечению. Хлороформ отгоняли на водяной бане досуха. Получали сухой остаток.

Количественное определение. Сухой остаток, полученный вышеизложенным методом, растворяли в 2 мл хлороформа. Пластинку «Силуфол УФ-254» (размером 20×20 см) делили на три равные полосы. Первую полосу оставляли в качестве контрольной; на стартовую линию второй полосы наносили в виде полосы длиной 4 см 0,1 мл испытуемого хлороформного раствора; на третью полосу – такой же длины 0,05 мл раствора стандартного образца атизина-хлорида.

Пластинку с нанесенными пробами подсушивали на воздухе в течение 15 мин. и помещали в камеру с системой растворителей хлороформ-бензол-диэтиламин (10:40:3,5). Когда фронт растворителей доходил до конца пластинки, ее вынимали из камеры, подсушивали на воздухе в течение 10 мин., затем в сушильном шкафу при температуре 100°С в течение 10 мин. Хроматографическую пластинку отмечали в УФ-свете (254 нм) зоны, содержащие атизина-хлорида в стандартном образце и в испытуемом хлороформном растворе (R_f ≈ 0.25). Зоны сорбента с двух полос и такой же по площади участок с контрольной полосы количественно переносили в колбы вместимостью 100 мл, приливали 10 мл 95% спирта, встряхивали в течение 2,5 ч., фильтровали через стеклянный фильтр пор 16.

Оптическую плотность полученных элюатов измеряли на спектрофотометре при длине волны 220 нм, в кюветах с толщиной слоя 10.мм.

В качестве раствора сравнения использовали элюат с зоны контрольной полосы.

Содержание атизина в абсолютно сухом сырье в процентах (х) вычисляли по формуле:

,

Где D – оптическая плотность элюата испытуемого раствора; D₀ – оптическая плотность элюата раствора стандартного образца атизина; m₀ – масса атизин-хлорида в граммах; m – масса сырья в граммах; W – влажность сырья в процентах; C₀ – содержание основного вещества в стандартном образце атизина в процентах; 0,906 – коэффициент пересчета, равный отношению молекулярных масс атизина основания и атизина хлорида:

Содержание атизина (с сопутствующими алкалоидами) в траве борца зеравшанского в пересчете на абсолютно сухое сырье должно быть не менее 0,2%.

Примечание. Приготовление раствора стандартного образца атизина-хлорида. Около 0,025 г (точная навеска) стандартного образца атизина-хлорида, предварительно высушенного до постоянной массы, растворяли в 2,5 мл этилового спирта 96% в колбе вместимостью 25 мл. Раствор использовали свежеприготовленным.

При проведении качественной реакции хлороформного извлечения из сырья с раствором кислоты кремневольфрамовой выпадает желтовато-белый осадок – явный признак алкалоидов.

В тонкослойной хроматографии наблюдается совпадение R_f значений из зон сорбций испытуемого и стандартного образца.

Метрологические характеристики метода анализа по количественному определению атизина в сырье из 5 определений показывает, что ошибка единичного определения не превышает допустимого. Исходя из этого, разработанная методика по качественному определению суммы алкалоидов и количественному определению алкалоида атизина может быть использована для оценки качества изучаемого растительного сырья.

Для переработки с целью производства субстанции препарата дигидроатизина гидрохлорида рекомендуем использовать растительное сырье с содержанием атизина не менее 0,2% от воздушно-сухой массы сырья.

Методика количественного определения апроби­рована на 5 сериях надземной части борца зеравшанского при изучении стабильности сырья методом «естественного старения». Сырье хранилось в складских неотапливаемых помещениях при температуре от 10 до 28°.

Изучение стабильности содержания атизина в сырье при хранении проводили в течение 3 лет и 6 месяцев. Снижение содержания атизина за этот период было незначительным и оставалось в пределах установленной нормы (табл. 1).

Таблица 1.

Результаты исследования стабильности качества травы борца зеравшанского при хранении

Также по числовым и другим показателям значительные отклонения от нормы не наблюдались. Срок годности рекомендуем установить 3 года.

Выводы.

Разработан метод качественного и количест­венного определения атизина в надземной части борца зеравшанского. Изучены условия спектро­фотометрического анализа. Рекомендуется использовать растительное сырье для переработки с содержанием атизина не менее 0,2% от воздушно-сухой массы сырья. Собранное сырье можно хранить в течение 3 лет, т. к. за этот период снижение содержания атизина в нем незначительно.