Выделение бактериофагов Y. Enterocolitica и селекция клонов

АННОТАЦИЯ

В статье представлены результаты работы по  выделению новых изолятов фагов вида Yersinia enterocolitica, и отбор наиболее перспективного штамма фага по характеристике таких биологических свойств как морфология негативных колоний и литическая активность.

ABSTRACT

The article presents the results of work on the isolation of new phage isolates of the species Yersinia enterocolitica, and selection of the most promising phage strain by characterizing such biological properties as the morphology of negative colonies and lytic activity.

Введение

Yersinia enterocolitica является возбудителем иерсиниоза - острого инфекционного заболевания, характеризующегося преимущественным поражением желудочно-кишечного тракта. Вид Y. enterocolitica широко распространен в природе. Представители вида присутствуют в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) различных животных, в воде, почве, а также могут контаминировать сырые овощи, молоко и другие продукты, хранящиеся в условиях холодильника [2-3].

Повсеместное распространение иерсиниоза, многообразие клиники его проявления и трудоёмкость в постановке диагноза сделали актуальной проблему кишечного иерсиниоза. Различные методы индикации и дифференциации Y. enterocolitica не идеальны и обладают некоторыми особенностями [4].

Решить данную проблему и предотвратить возникновение заболевания можно при использование бактериофагов - естественных природных врагов бактерий, в качестве профилактических и терапевтических препаратов. 

В связи с этим целью нашей работы было выделение бактериофагов бактерий вида Yersinia enterocolitica из объектов внешней среды и их селекция.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Выделить иерсиниозные бактериофаги из внешней среды;
2. Селекционировать полученные бактериофаги;

Материалы и методы

Штаммы бактерий: в работе были использованы 34 штамма бактерии вида Y. enterocolitica полученные из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ Ульяновской ГСХА и выделение нами из объектов окружающей среды. Культуры бактерий обладали типичными для данного вида культуральными, морфологическими и биохимическими свойствами.

Бактериофаги: 5 бактериофагов бактерий вида Y. enterocolitica, выделенные нами из внешней среды.

Объекты внешней среды. В качестве объектов внешней среды использовали: бытовые сточные воды, воду открытых водоемов (рек Волга, Свияга и Сура), фекалии животных и пробы почвы с выгульных площадок для животных г. Ульяновска и Ульяновской области.

Оборудование и лабораторная посуда

Термостат ТС-80М-2, автоклав ГК-100-3, шкаф сушильно стерилизационный ШСС-80п УХЛ 42, холодильник бытовой “Бирюса” СПО 4М1-16-4М1, дистиллятор, микроскоп «Биомед-6» с видеофотонасадкой, центрифуга; автоматические пипеточные дозаторы на 20 мкл, 100 мкл и 1000 мкл «Gilson», «Ленпипет», «Eppendorf», бактериальные фильтры.

Для проведения боксовых работ использовали комплект посуды, включающий колбы мерные, пипетки, чашки Петри, цилиндры мерные, и флаконы различного объёма.

При работе с культурами использовали стандартные бактериологические методы.

Работа с бактериофагами проводилась по методикам, апробированными сотрудниками кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГБОУ ВО Ульяновская ГСХА [1, 3, 5].

С целью получения чистых линий фагов и повышения их литической активности проводили пассажи выделенных изолятов на индикаторных культурах с периодическим клонированием типичных негативных колоний до получения их однородной популяции.

Морфологию негативных колоний фагов изучали при посевах фагов методом агаровых слоев. Литическую активность фагов определяли методам серийных разведений в жидкой питательной среде и методам агаровых слоев.

Результаты исследований

Первым этапом при работе с культурами является проверка их на лизогенность, поэтому все штаммы, используемые нами как индикаторные, исследовались на возможность выделения бактериофагов из культур в присутствии индуцирующего агента и без него.

В первой серии опытов использовали методику, предложенную С. Лурия, Д. Дарнеллом, для выделения бактериофагов из бактерий вида Y. enterocolitica  без воздействия на них индуцирующего фактора. В процессе работы свободного фага из культур бактерий вида Y. enterocolitica  выявлено не было.

Во второй серии опытов на исследуемые культуры, воздействовали индуцирующим фактором. В качестве индуцирующего агента использовали ультрафиолетовые лучи (УФ-лучи), источником которых служила ртутно-кварцевая лампа, дающая не менее 90 % излучаемой энергии в виде УФ-лучей с длиной волны 254 нм. Облученные взвеси культур смешивали с культурами, культивировали в течение суток, после чего фильтровали через бактериальные фильтры [1]. Полученный фильтрат исследовали на наличие фага на имеющихся культурах Y. enterocolitica  методом агаровых слоев. В наших опытах установлено, что воздействии индуцирующего фактора на бактерии вида Y. enterocolitica  не приводили к появлению зон лизиса.

Анализируя полученные данные, можно утверждать, что мы не обнаружили явления выхода свободного фага и перехода профага в свободный фаг у имеющихся штаммов бактерий по данным схемам.

Дальнейшие исследования были посвящены выделению бактериофагов Y. enterocolitica  из объектов внешней среды.

Жидкие пробы (бытовые сточные воды, воду открытых водоемов) фильтровали через бумажный фильтр для освобождения от механических примесей в случае необходимости. В 1,0 литровую колбу, содержащую стерильный, МПБ в количестве 0,5 литра, вносили 50,0 мл фильтрата либо навеску 50,0 г, в случаях исследования фекалий животных и проб почвы с выгульных площадок для животных и по 1,0 мл, индикаторных штаммов бактерий. Колбу инкубировали в термостате в течении 24 часов при 37°С. После этого содержимое колбы разливали в пробирки, центрифугировали при 3000 об/мин в течении 30 минут, шприцом отбирали надосадочную жидкость и фильтровали с помощью бактериального фильтра в стерильную пробирку. Фильтраты исследовали по методу Отто. Чашки помещали в термостат на 18-20 часов при 37°С. Наличие негативных колоний или зон лизиса на газоне роста индикаторной культуры свидетельствует о присутствии в исследуемом материале бактериофага (рис.1).

Селекцию выделенных бактериофагов и повышение их литической активности проводили с помощью пассирования фага на индикаторной культуре с периодической отвивкой типичных негативных колоний по методике, описанной И.М. Габриловичем (1973) и С.Н. Золотухиным (2007) [3].

В результате проведенных исследований удалось выделить 5 изолятов бактериофагов, которые отличались между собой по морфологии негативных колоний. Результаты представлены в таблице 1.

Рисунок 1. Негативные колонии фага в зоне «стекающей капли»

Таблица 1

Описание морфологии негативных колоний фагов Y. enterocolitica

Селекцию бактериофагов проводили многократным пассированием изолированных негативных колоний с индикаторной культурой в МПБ. Использовали соотношение 0,5 мл фага на 0,2 мл индикаторной культуры. Время постановки пассажа – 6 часов инкубирования при температуре 37±1 ⁰С.

После серии пассажей, мы проверили литическую активность выделенных бактериофагов. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Литическая активность выделенных ирсиниозных бактериофагов

Выводы

Из более чем 30 проб бытовых сточных вод, вод открытых водоемов (рек Волга, Свияга и Сура), фекалий животных и проб почвы с выгульных площадок для животных г. Ульяновска и Ульяновской области, нами было выделено 5 бактериофагов бактерий Y. enterocolitica. После многократного пассирования полученных фагов и проведения исследований по изучению морфологии негативных колоний фагов и их литической активности, для дальнейших исследований нами был отобран фаг Ye3-f2. Он обладает высокой литической активностью 1,5±0,1×10¹⁰ по Грация и 10-⁹ по Аппельману и дает прозрачные негативные колонии без зоны неполного лизиса диаметром 1,0-1,5.

Таким образом, бактериофаг Ye3-f2 обладает всеми свойствами необходимыми для использования его в составе биопрепарата для для фаговой терапии сельскохозяйственных животных.

Исследования проводятся при поддержке государства в лице ФГБУ «Российский фонд фундаментальных исследований» по научному проекту «Геномика и биология кандидатных бактериофагов для терапии энтеробактериальных инфекций в ветеринарной медицине» №16-44-732038/16 от 03.11.2016 г.