Подбор методики выделения бактериофагов рода Proteus

АННОТАЦИЯ

В статье описаны результаты исследований по подбору максимально результативной методики для выделения бактериофагов, специфичных бактериям рода Proteus. Установлено, что методом индукции (воздействие ультрафиолетовых лучей) выделить бактериофаги не удалось: профаг у 16 исследованных бактерий рода Proteus не был выявлен. Методика выделения фагов из объектов окружающей среды дала положительные результаты - из 94 проб сточных вод, фекалий, смывов с клеток, почвы с территории ферм было выделено 8 бактериофагов, специфичных к бактериям рода Proteus. Была модифицирована методика выделения бактериофагов: при выделении фага из объектов ветеринарно-санитарного надзора по классической методике Гольдфарба Д.М. (1961) этап высева цетрифугата методом агаровых слоев по Gracia (1936) был заменен в протоколе исследований на этап высева методом Отто «стекающая капля».

ABSTRACT

In article results of researches on selection of the most productive technique for allocation of the bacteriophages specific to sort Proteus bacteria are described. It is established that the induction method (influence of ultraviolet rays) hasn't succeeded to allocate bacteriophages: the pro-phage at 16 studied bacteria of the sort Proteus hasn't been revealed. The technique of allocation of phages from objects of the environment has yielded positive results - from 94 tests of sewage, excrements, washouts from cages, soils from the territory of farms 8 bacteriophages specific to sort Proteus bacteria have been allocated. The technique of separation of bacteriophages was modified: in case of separation of a phage from objects of veterinary sanitary inspection by a classical technique of Goldfarb D.M. (1961) the stage of seeding of a tsetrifugat by method of agar layers on Gracia (1936) was replaced in the protocol of researches with a seeding stage with Otto's method "the refluxing drop".

По литературным данным бактерии широко распространены во внешней среде и обладают высокой устойчивостью к факторам внешней среды, в незначительном количестве обитают в кишечнике здоровых животных, человека и птиц, часто становятся причиной болезни молодняка сельскохозяйственных животных и птицы, находящихся в иммунодепрессивном состоянии и наиболее подверженных стрессам [1, с. 23; 2, с. 30]. Известно, что вспышки протейной инфекции регистрируются преимущественно спорадически, в случаях эпизоотии в стаде,  бактерии рода Proteus играют сопряженную роль секундарной инфекции при смешанном (ассоциативном) инфекционном поражении [5, с.174; 6, с. 35; 10, с. 77]. Бактерии рода Proteus – прямые, подвижные грамотрицательные палочки 0,4-0,8х1-3 мкм, большинство штаммов обладают способностью к роению, образуя на скошенной поверхности агара вуалеобразный голубоватый налет с характерным гнилостным запахом, они отличаются от других энтеробактерий наличием фенилаланиндезаминазы [11, с.8].

Для диагностики, лечения и профилактики дисбиозов, возбудителем которых являются протеи в смешанной или монокультурах, в медицинской практике применяются фаговые биопрепараты. В ветеринарии данные методики не нашли широкого распространения, что связано с ограниченным количеством специфических бактериофагов на фармацевтическом рынке.

Цель и задачи исследований

Цель работы – выделение фагов, специфичных для бактерий рода Proteus, из патологического материала и объектов санитарного надзора животноводческих и птицеводческих помещений из хозяйств, неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям, которые могут быть использованы с целью конструирования фагового биопрепарата для диагностики, профилактики и лечения дисбиозов, возбудителем которых являются протеи в смешанной или монокультурах, и их селекция.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

-  провести эксперименты по выделению бактериофагов методом индукции на штаммах Proteus;

-  провести эксперименты по выделению бактериофагов Proteus из объектов окружающей среды;

-  подобрать оптимальные параметры культивирования выделенных бактериофагов и способы очистки бактериофагов от индикаторной культуры.

Методика исследований

Штаммы бактерий рода Proteus были выделены коллективом авторов из патологического материала и фекалии от телят, поросят и птицы (куры и утки) с клиническими признаками дисбактериоза, фекалии и смывы животноводческих и птицеводческих хозяйств, неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям Ульяновской и Самарской областей. Для исследований было взято 94 пробы патологического материала (трупы телят, поросят и кур, объекты санитарного надзора животноводческих и птицеводческих помещений из хозяйств, неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям (сточные воды, фекалии, смывы с клеток, почва с территории животноводческих ферм) Ульяновской, Самарской и Пензенской областей).

Выделение бактериофагов и подбор оптимальных параметров их культивирования проводили с использованием методик, опробированных сотрудниками кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГБОУ ВО Ульяновская ГСХА [9, с.26; 12, с. 88; 13, с.186; 14, с. 197]. В исследованиях применяли питательный бульон ТУ 10-02-02-789-176-94 (ООО «БиоКомпас-С», РФ), питательный агар для культивирования микроорганизмов  сухой (ГРМ-агар) ТУ 9398-020-78095326-2006 (ФБУН ГНЦ ПМБ, РФ), генцианвиолет 548-62-9 (ЗАО «Вектон», РФ), трихлорметан стабилизированный 0,6-1 % этанола (хлороформ) ч.д.а. ТУ 2631-066-44493179-01. Контроль специфической активности бактериофагов проводили с помощью специально подобранных наборов контрольных штаммов. Концентрацию микробных клеток определяли с помощью оптического стандарта мутности (ОСО 42-28-85 на 10 ед. производства ГИСК им. Л.А. Тарасевича).

Результаты исследований

В первой серии экспериментов на 16 культур бактерий рода Proteus, которые мы исследовали как «лизогенные», воздействовали индуцирующим фактором (применяли воздействие на бактерии ультрафиолетовых лучей).

Анализ литературных данных свидетельствует о том, что при действии на лизогенные культуры индуцирующим фактором продукция фага в значительной степени возрастает, поэтому применяя данную методику удается выявить бактериофаг в значительно большем проценте случаев, чем при изучении только спонтанной его продукции [3, с. 8; 4, с.10].

В качестве источника ультрафиолетовых лучей применялась бактерицидная лампа, 80 % энергии которой приходится на длину волны 2537 Ǻ. Исследуемые культуры в период эксперимента (16 культур бактерий, идентифицированных как Proteus) находились в экспоненциальной фазе роста. Суточная культура бактерий разводилась в соотношении 1:100 в фосфатном буфере с рН 7,6. Разведение бактерий в объеме 2 мл помещали в чашку Петри и облучали в течение 20 (25, 30, 35, 40) секунд на расстоянии 40 (45, 50, 55, 60) см. Затем облученные культуры рода Proteus засевались на мясо-пептонный бульон (МПБ) комнатной температуры (20-22 ⁰С) в соотношении 1:100. Эксперимент проводился в полузатемненном помещении с целью предохранения облученных бактерий рода Proteus от фотореактивации. Посевы инкубировали при 36±1 ⁰С в течение 6,5-7,0 часов, после чего делали высев методом агаровых слоев по Gracia (1936).

Известно, что лизогения широко распространена среди всех систематических групп микроорганизмов, но нам не удалось выявить профаг у выделенных культур рода Proteus.

Второй этап исследований был посвящен выделению бактериофагов из объектов ветеринарно-санитарного надзора. Для исследований был произведен отбор 94 проб патологического материала (трупы телят, поросят и кур, объекты ветеринарно-санитарного надзора животноводческих и птицеводческих помещений из хозяйств, неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям (сточные воды, фекалии, смывы с клеток, почва с территории животноводческих ферм)).

Первоначально готовили разведения из объектов исследований в МПБ в соотношении 1:10, добавляли в концентрации 10⁴ КОЕ /мл по 1,0 мл каждого из 16 штаммов бактерий рода Proteus. Колбы с пробами ставили в термостат на 24 часа при температуре 36±1 ⁰С. Затем пробы фильтровали через ватно-марлевый фильтр для освобождения от механических примесей. После этого содержимое колбы разливали в стерильные пробирки, центрифугировали при 3000 об./мин в течение 30 минут, далее прогревали в водяной бане при 62±2 ⁰С в течение 30 минут с целью подавления роста грамотрицательных бактерий.

Каждый исследуемый фильтрат исследовался нами на наличие фага методом Отто «стекающая капля».

Результаты оценивали следующим образом: - отсутствие лизиса;

+ лизис по ходу стекания капли;

++ лизис по ходу стекания капли и наличие стерильных пятен;

+++ наличие стерильного пятна и зон лизиса.

Установлено, что на газоне культур 16 культур бактерий рода Proteus  выявлены зоны лизиса, оцененные в +, ++ и +++ (один, два и три креста) из проб сточных вод 1 (на индикаторной культуре Proteus vulgaris 1 - зона лизиса ++), из пробы почвы 2 (на культуре Proteus vulgaris 3 – зона лизиса - +++), из фекалий КРС (на культуре Proteus vulgaris 13 – зона лизиса - +); смыв с клетки (на индикаторной культуре Proteus vulgaris 16 - зона лизиса была оценена на +++); сточные воды 12 (на культуре Proteus vulgaris 33 – зона лизиса - +); сточные воды 5 (на культуре Proteus vulgaris 28 – зона лизиса - ++); из пробы почвы 4 (на культуре Proteus vulgaris 38 – зона лизиса - ++); фекалии свиней (на культуре Proteus mirabilis 12 – зона лизиса -  +).

При выделении фага из объектов ветеринарно-санитарного надзора по классической методике Гольдфарба Д.М. (1961) [3, с. 6] этап высева цетрифугата методом агаровых слоев по Gracia (1936) был заменен в протоколе исследований на этап высева методом Отто «стекающая капля». Это было сделано с целью экономии расходных материалов и снижения трудозатрат. Также нами было установлено, что при первичном выявлении бактериофага метод Отто позволяет четко видеть его наличие или отсутствие, в то время как метод агаровых слоев по Gracia (1936) затрудняет этап «визуального выявления бактериофага на газоне культуры». Для подтверждения мы провели эксперименты, заключающиеся в том, что каждый из 8 фильтратов был исследован на наличие фага методом агаровых слоев по Gracia (1936).

Установлено, что на газоне культур Proteus vulgaris 1 , Proteus vulgaris 3, Proteus vulgaris 13, Proteus vulgaris 16, Proteus vulgaris 33, Proteus vulgaris 28, Proteus vulgaris 38, Proteus mirabilis 12 выявлены зоны лизиса. Затраты на постановку эксперимента в несколько раз больше и при аналогичном результате, что и при применении метода Отто.

Нами из 94 проб объектов ветеринарно-санитарного надзора было выделено 8 бактериофагов, специфичных для штаммов Proteus vulgaris и Proteus mirabilis.

Заключение

Были проведены исследования по выявлению бактериофагов, специфических к бактериям Proteus vulgaris и Proteus mirabilis методом индукции из выделенных нами ранее протейных культур. Были получены отрицательные результаты, которые не расходятся с данными исследователей, занимавшихся выделением бактериофагов семейства Enterobacteriaceae, утверждающих, что наиболее перспективным является методика выделения бактериофагов из объектов окружающей среды [7, с. 183; 8, с. 85; 11, с. 10].

Из 94 проб объектов ветеринарно-санитарного надзора животноводческих и птицеводческих помещений из хозяйств, неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям, было выделено 8 бактериофагов, специфичных к бактериям рода Proteus. Установлено, что объектами для выделения вирулентных бактериофагов рода Proteus являются сточные воды, фекалии, смывы с клеток, почва с территории животноводческих ферм.

Исследования проводятся при поддержке государства в лице ФГБУ «Российский фонд фундаментальных исследований» по научному проекту «Геномика и биология кандидатных бактериофагов для терапии энтеробактериальных инфекций в ветеринарной медицине» №16-44-732038/16 от 03.11.2016 г.