Скрининг генов α-кетоглутарат-зависимой 2,4-Д-диоксигеназы

АННОТАЦИЯ

В настоящее время наблюдается интерес к изучению проблемы контроля над повсеместно нарастающим химическим загрязнением окружающей среды. Известно, что организм человека обладает механизмами выведения и обезвреживания опасных соединений. Более того, собственные системы человека получают поддержку от симбиотической микрофлоры, также участвующей в конверсии экзогенных токсикантов [8, с. 129].

Несмотря на то, что изучение положительных взаимоотношений между человеком и микроорганизмами позволяет провести не только мониторинг, но и предупреждение болезней, вызванных загрязнением окружающей среды, проблема генетического контроля над конверсией экотоксикантов в микробиоценозах человека остается малоизученной.

В настоящей работе проведен скрининг генов α-кетоглутарат 2,4-Д-зависимой диоксигеназы, контролирующей конверсию арилоксиалкил-карбоновой кислоты, являющейся действующим веществом серии гербицидов избирательного действия. Детекцию генов tfdA в метагеноме микробиоты репродуктивного тракта человека проводили методом ПЦР, позволяющим при использовании специально подобранных праймеров идентифицировать генетические мишени в любой биопробе. ПЦР-анализ не выявил присутствие гомологов гена tfdA, что свидетельствует в пользу того, что контроль над содержанием 2,4-Д в репродуктивном тракте человека осуществляется за счет иных генетических систем.

ABSTRACT

Currently, the increasing interest in studying of chemical environmental pollution control is observed. It is known that the human body possesses mechanisms of removal dangerous compounds and its neutralization. Moreover, own personal systems are supported by symbiotic microflora which is also participating in exogenous toxins conversion [8, р. 129].

In spite of the fact that the studying of positive relationship between the humans and microorganisms allows not only monitoring, but prevention of the diseases caused by environmental pollution, a problem of genetic control over toxicants conversion in human micriobiome remains low-studied.

In this work screening of α-ketoglutarate 2,4-D-dependent dioxygenase genes (tfdA), controlling conversion of the aryloxyalkylcarboxylic acid, which is an active ingredient of herbicides series, has been done. Detection of tfdA genes in human reproductive tract metagenome microbiota was performed by PCR, allowing to identify genetic targets in any biological sample. PCR-analysis didn't reveal presence of tfdA gene homologs. Received result specifies that control over the 2,4-D content in the human reproductive tract is carried out by other genetic systems.

Введение

Известно, что микрофлора человека представляет собой динамическую систему, находящуюся в прямой зависимости от внешней среды, она первой вовлекает в обмен веществ естественные и чужеродные субстанции. В этом контексте важное значение имеет способность симбионтных микроорганизмов микрофлоры к конверсии токсичных соединений в производные, доступные для дальнейших метаболических реакций. Направленные на превращения ксенобиотиков ферменты должны быть достаточно универсальными для акцептирования молекул с широким диапазоном масс и пространственных особенностей. В ряде исследований было показано, что активность ферментов, катализирующих начальные этапы конверсии гербицидов, в том числе 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты
(2,4-Д), находится под контролем генов оксигеназ.

Цель настоящей работы – скрининг генов α-кетоглутарат-зависимой 2,4-Д- диоксигеназы в метагеноме микробиоты человека.

Методы исследования

Объектами исследований служили пробы микроорганизмов, составляющих микрофлору репродуктивного тракта человека. Для выделения препаратов ДНК применяли стандартную методику с небольшими модификациями [2, с. 496–497]. Скрининг осуществляли методом ПЦР с применением модифицированных праймеров, разработанных для анализа консервативных регионов гена tfdA f 5’-GAGCACTACGCACTGAACTCCCG-3’ и r 5’-CTTCGGCCACCGGAAGGCCT–3’ [6, с. 245-246]. Ожидаемый размер ПЦР-продукта составлял 200 п.н. В реак-ционную смесь при получении ПЦР-продуктов вносили: 67 mM Tris-HCl (pH 8.3), 17 mM (NH4)2SO4, 0.001 % Tween 20, 2.5 mM MgCl2, 25 пмоль каждого праймера, 2 мМ dNTP – 1.0 мкл и 1.25 единиц Taq-полимеразы (Sigma), ДНК матрицу – 1 мкл; H2O – до 10 мкл. Накопление ПЦР-продуктов проводили в амплификаторе TС 2720 (Applied biosystems, США). В качестве контроля использовался образец ДНК штамма Ralstonia eutropha JMP134. Электрофоретическое фракционирование фрагментов ДНК проводили в 2 % агарозном геле. При определении длины продуктов амплификации использовали маркер, состоящий из фрагментов ДНК в диапазоне 100–1000 п.н. Полосы ДНК после окрашивания бромистым этидием визуализировались в геле в виде оранжевых полос, светящихся при экспозиции в УФ-спектре.

Обсуждение результатов

В 1979 году Pemberton и соавторы показали, что Ralstonia eutropha JMP134 [7, с. 287–299] несет на плазмиде pJP4 структурные и регуляторные гены, необходимые для преобразования 2,4-Д, используемой в качестве действующего вещества ряда системных гербицидов, неограниченно применяемых на посевах зерновых культур. Обнаружены и другие микроорганизмы, вовлекающие в обмен веществ молекулы хлорфено-ксикислот [1, с. 194–195].

В серии работ было показано, что ген tfdA кодирует α-кетоглутарат (α-КГ)-зависимую 2,4-Д-диоксигеназу, которая катализирует превращение 2,4-Д в доступный для воздействия других ферментов 2,4-дихлорфенол и глиоксилат, окисляя α-КГ до CO₂ и сукцината [3, с. 3300; 4, с. 2085; 5, с. 24311; 9, с. 2952–2954; 10, с. 2458].

В настоящей работе для детекции генов α-кетоглутарат-зависимой 2,4-Д-диоксигеназы в метагеноме микробиоты человека был применен высоко-специфичный и чувствительный ПЦР-анализ, позволяющий при использовании специально подобранных праймеров идентифицировать генетические мишени в любой биопробе.

На начальном этапе при проверке праймеров гена tfdA была проведена ПЦР с контрольным образцом ДНК штамма R. eutropha JMP134 в следующем режиме: в течение 2 мин проводилась денатурация препарата ДНК при 95°С, после этого было проведено 30 циклов амплификации фрагментов ДНК, каждый из которых включал стадию денатурации в течение 45 сек при 94°С, стадию отжига праймеров длительностью 30 сек при 64°С и стадию элонгации в течение 60 сек при температуре 72°С. На заключительной стадии для завершения построения комплементарных цепей ДНК реакционная смесь в течение 2 мин инкубировалась при оптимальной для активности Taq-полимеразы температуре 72°С, что исключило образование недостроенных молекул ДНК.

Электрофоретический профиль фракционирования ПЦР-ампликонов, представленный на рисунке 1 показывает, что праймеры в выбранном режиме ПЦР обеспечивают образование целевых фрагментов ДНК размером 200 п.н.

Рисунок 1. Результаты фракционирования в 2 % агарозном геле
ПЦР-амплификатов, полученных при анализе контрольных образцов.
Условные обозначения: м–препарат маркерной ДНК фага λ, рестриктированной эндонуклеазой PstI, 1–препарат ДНК штамма R. eutropha JMP134 (положительный контроль), 2–реакционная смесь
для ПЦР (отрицательный контроль)

Указанные выше основные условия ПЦР были приняты за рабочий режим дальнейшего скрининга генов α-кетоглутарат 2,4-Д-зависимой диоксигеназы в метагеноме микроорганизмов, составляющих микрофлору репродуктивной системы человека, они отражены в таблице 1.

По ходу поиска генов tfdA использовалось 68 свободных от ингибиторов реакции амплификации препаратов метагеномной ДНК. Результаты фракционирования ПЦР-продуктов исследуемых образцов представлены на рисунке 2.

Как видно из рисунка 2 ПЦР-анализ препаратов метагеномоной ДНК микробиоты репродуктивного тракта человека не выявил присутствие последовательностей, обладающих гомологией к гену tfdA.

 Таблица 1.

Режим амплификации фрагментов гена α-кетоглутарат-зависимой диоксигеназы

Согласно рассуждениям, изложенным выше, электрофоретический профиль ПЦР-амплификатов гена tfdA свидетельствует в пользу того, что контроль над содержанием 2,4-Д в репродуктивном тракте человека осуществляется за счет иных генетических систем.

Рисунок 2. Результаты фракционирования в 2 % агарозном геле ПЦРамплификатов, полученных при анализе образцов микробиоты репродуктивного тракта человека. 1–препарат маркерной ДНК фага λ, рестриктированной эндонуклеазой PstI, 2–препарат ДНК штамма R. eutropha JMP134 (положительный контроль); 3-13 – образцы метагеномной ДНК микробиоты человека, 14 – реакционная смесь для ПЦР (отрицательный контроль)

Заключение

Оценивая полученные результаты, следует обратить внимание на то, что изучение микроорганизмов человека сегодня производится в формате национальных и глобальных международных проектов [2, с. 495; 4, с. 2083]. Под пристальное внимание попали пять обильно населенных различными видами микробов ключевых экотопов человеческого тела, а именно: кишечник, полость рта, дыхательные пути, кожные покровы и мочеполовая система, выполняющие важные роли в поддержании иммунитета, обмена веществ, дыхания и других функций. Среди микробов кожи верхней конечности человека обнаружены бактерии, способные к метаболизму бензо[а]пирена [8, с. 132]. Результаты настоящей работы раскрывают особенности контроля над гербицидом 2,4-Д у микробиоты репродуктивного тракта человека.