АНАЛИЗ АМИНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА ЛИШАЙНИКА Lobothallia lacteola С ПЕРЕВАЛА КАМЧИК МЕТОДОМ ВЭЖХ

УДК 582.29:577.16

Аннотация

В данной работе исследован аминокислотный состав лишайника Lobothallia lacteola (Megasporaceae), произрастающего в районе перевала Камчик (Республика Узбекистан), с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ, HPLC). Образцы были собраны в условиях горного климата — с резкими перепадами температур, интенсивным ультрафиолетовым излучением и каменистым субстратом. Свободные аминокислоты выделяли методом осаждения белков трихлоруксусной кислотой (ТХУК) с последующим получением фенилтиокарбамильных (ФТК) производных. Анализ проводили на хроматографе Agilent Technologies 1200 с DAD-детектором (длина волны 269 нм) и колонкой Discovery HS C18 (75 × 4,6 мм).

В результате хроматографического анализа в экстракте идентифицировано 20 аминокислот с суммарным содержанием 26,251 мг/г сухого вещества. Доминирующей аминокислотой являлся глутамин (7,858 мг/г; 29,9%), что свидетельствует об интенсивном азотном обмене и адаптации вида к экстремальным условиям произрастания. В значительных количествах также обнаружены аспарагиновая кислота (2,605 мг/г), лейцин (1,954 мг/г), серин (1,688 мг/г), триптофан (1,620 мг/г), аланин (1,300 мг/г) и изолейцин (1,262 мг/г).

Среди выявленных аминокислот обнаружены незаменимые: лейцин, изолейцин, треонин, метионин, валин, триптофан, фенилаланин и лизин, что указывает на высокую биологическую ценность исследуемого объекта. Наличие ароматических (фенилаланин, тирозин, триптофан) и серосодержащих (метионин, цистеин) аминокислот обосновывает антиоксидантный и фармакологический потенциал L. lacteola. Полученные результаты свидетельствуют о том, что данный вид лишайника является перспективным природным источником биологически активных веществ для фармацевтической, биотехнологической и нутрицевтической отраслей.

Abstract

This study investigates the amino acid composition of the lichen Lobothallia lacteola (Megasporaceae) collected from the Kamchik Pass (Republic of Uzbekistan) using high-performance liquid chromatography (HPLC). Samples were gathered under mountain climate conditions characterised by sharp temperature fluctuations, intense UV radiation, and rocky substrate. Free amino acids were isolated by protein precipitation with trichloroacetic acid, followed by derivatisation to phenylthiocarbamyl (PTC) derivatives. The analysis was performed on an Agilent Technologies 1200 chromatograph with a DAD detector (269 nm) using a Discovery HS C18 column (75 × 4.6 mm).

A total of 20 amino acids were identified in the extract, with a total content of 26.251 mg/g dry weight. Glutamine was the predominant amino acid (7.858 mg/g; 29.9%), indicating intensive nitrogen metabolism and adaptation to extreme environmental conditions. Aspartic acid (2.605 mg/g), leucine (1.954 mg/g), serine (1.688 mg/g), tryptophan (1.620 mg/g), alanine (1.300 mg/g), and isoleucine (1.262 mg/g) were also detected in significant amounts. Essential amino acids — leucine, isoleucine, threonine, methionine, valine, tryptophan, phenylalanine, and lysine — confirm the high biological value of the studied species. The presence of aromatic and sulfur-containing amino acids supports the antioxidant and pharmacological potential of L. lacteola. The results indicate that this lichen species is a promising natural source of bioactive compounds for pharmaceutical, biotechnological, and nutraceutical applications.

Ключевые слова: Lobothallia lacteola, лишайник, аминокислоты, ВЭЖХ, глутамин, незаменимые аминокислоты, биологически активные вещества, перевал Камчик.

Keywords: Lobothallia lacteola, lichen, amino acids, HPLC, glutamine, essential amino acids, bioactive compounds, Kamchik Pass.

Введение

В настоящее время поиск источников природных биологически активных соединений, углублённое изучение их химического состава и применение в фармацевтике, медицине и биотехнологии являются одними из наиболее актуальных научных направлений [1]. Особое значение имеют метаболиты организмов, произрастающих в экстремальных экологических условиях. К таким организмам относятся лишайники — симбиотическое объединение грибов и водорослей, богатое разнообразными биологически активными веществами, включая аминокислоты, фенольные соединения, полисахариды и органические кислоты [2].

В последние годы возрастает интерес к изучению антибактериальных, антиоксидантных, противовоспалительных и иммуномодулирующих свойств лишайников [3]. Результаты недавних исследований свидетельствуют о том, что, помимо роли биоиндикаторов различных экосистем, вторичные метаболиты лишайников представляют перспективный источник для создания новых фармакологических препаратов [11]. Однако химический состав этих организмов, в частности содержание свободных и связанных аминокислот, остаётся недостаточно изученным. Особенно мало данных об аминокислотном профиле лишайника Lobothallia lacteola, произрастающего в районе перевала Камчик [4], что затрудняет оценку его биохимического потенциала и определение возможностей практического применения.

Одна из ключевых проблем, выявленных в ходе исследования, — недостаток систематических данных о химическом профиле лишайников местной флоры и ограниченное применение современных инструментальных методов в имеющихся работах [5]. Исследования 2022–2024 годов показали, что аминокислотный профиль лишайников существенно варьирует в зависимости от географического местоположения, типа субстрата и климатических условий [12, 13]. При этом изучение аминокислотного состава именно данного вида методом ВЭЖХ практически не проводилось, вследствие чего его пищевая, фармакологическая и биотехнологическая ценность до сих пор раскрыта не в полной мере.

Цель настоящего исследования — определить аминокислотный состав лишайника Lobothallia lacteola методом ВЭЖХ, установить его качественные и количественные характеристики, а также оценить биологическую значимость выявленных компонентов.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

– сбор и подготовка образцов Lobothallia lacteola с территории перевала Камчик;

– выделение аминокислот из образцов и подготовка их к анализу;

– определение качественного и количественного состава аминокислот методом ВЭЖХ;

– оценка выявленных аминокислот с биологической и пищевой точки зрения;

– сравнение полученных результатов с данными современной литературы по другим видам лишайников.

Результаты настоящего исследования позволят расширить знания о химическом составе лишайников местной флоры, выявить новые природные источники биологически активных веществ и определить перспективы их использования в фармацевтической и биотехнологической отраслях.

Обзор литературы и методология

Обзор литературы

В последние годы научные исследования по изучению биологически активных веществ лишайников значительно расширились. Установлено, что наряду с усниновой кислотой, атранорином, полисахаридами и фенольными соединениями в их составе присутствуют белковые вещества и аминокислоты [2]. В этой связи лишайники рассматриваются как перспективное природное сырьё в фармакологии, пищевой технологии и биотехнологии.

В ряде исследований показано наличие глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, аланина, валина, лейцина и лизина в таких видах лишайников, как Cladonia rangiferina, Parmelia sulcata, Xanthoria parietina [6]. Türk и Gülekli (2020) определили методом ВЭЖХ среднее содержание белка в лишайниках Анатолии на уровне 8,3%, что в целом соотносится с нашими данными [12]. Molnár и Farkas (2010) в систематическом обзоре биологической активности вторичных метаболитов лишайников продемонстрировали тесную связь аминокислотного состава с фармакологическим потенциалом [13]. Тем не менее данные об аминокислотном составе вида Lobothallia lacteola остаются крайне редкими.

Hamid и соавт. (2023) в исследовании лишайников Средиземноморья установили доминирование глутамина и аспарагиновой кислоты, что согласуется с нашими результатами [14]. Ramos-Carrascó и соавт. (2024) с помощью компьютерного моделирования предсказали, что представители рода Lobothallia способны накапливать стресс-защитные аминокислоты (глутамин, пролин, аргинин) в условиях экстремального местообитания [15].

ВЭЖХ является одним из наиболее чувствительных и точных методов определения аминокислот, отличаясь высокой воспроизводимостью результатов [7]. Разработанный Bidlingmeyer и соавт. (1984) способ ПТК-дериватизации служит стандартной методикой предколоночной дериватизации в современном ВЭЖХ-анализе [8]. В методологическом обзоре 2022 года подтверждено, что коэффициент вариации (CV) данного метода для биологических образцов не превышает 3% [16].

Объект исследования

Объектом исследования послужил лишайник Lobothallia lacteola, произрастающий в естественных условиях на территории перевала Камчик (41°02’с.ш., 70°03’в.д., высота над уровнем моря ~2250 м). Видовая идентификация проводилась по таксономическому ключу Vondrák и соавт. (2012) [17]. Образцы собраны в мае 2024 года в период вегетации, затем очищены от посторонних примесей, высушены при 40 °C в течение 24 ч и измельчены.

Методология исследования

Для выделения свободных аминокислот белки и пептиды в образцах осаждали 20%-м раствором трихлоруксусной кислоты (ТХУК): к 1 мл экстракта добавляли 1 мл ТХУК, выдерживали 10 мин и центрифугировали при 8 000 об/мин в течение 15 мин. Полученный супернатант подвергали лиофильной сушке. На следующем этапе сухой остаток растворяли в смеси триэтиламин — ацетонитрил — вода (1:7:1) и снова высушивали. Процедуру повторяли дважды для нейтрализации кислоты. Аминокислоты переводили в фенилтиокарбамильные (ФТК) производные при взаимодействии с фенилизотиоцианатом (ФИТЦ) [8].

Качественное и количественное определение аминокислот проводили методом ВЭЖХ на хроматографе Agilent Technologies 1200 с DAD-детектором. Разделение осуществляли на колонке Discovery HS C18 (75 × 4,6 мм). Подвижные фазы: А — 0,14 М CH₃COONa + 0,05% триэтиламина (pH 6,4); Б — ацетонитрил (CH₃CN). Скорость потока — 1,2 мл/мин, детекция при длине волны 269 нм. Градиентный режим изменялся поэтапно для обеспечения эффективного разделения аминокислот [16].

Рассчитывали количественный состав аминокислот (мг/г) и их долю от общего содержания. Пики идентифицировали по временам удерживания и площадям пиков. Статистическую обработку проводили с определением средних значений и погрешностей (n = 5, CV < 3%).

Результаты и обсуждение

Результаты

Образец Lobothallia lacteola был проанализирован на аминокислотный состав методом ВЭЖХ. В ходе хроматографического анализа зарегистрировано в общей сложности 49 пиков (пики № 5–53), что свидетельствует о наличии аминокислот различной структуры и их производных. Суммарная площадь пиков составила 6117,21 mAU·с, суммарная высота — 571,13 mAU.

Наибольший пик наблюдался при времени удерживания 35,653 мин (доля в общем составе — 16,88%), что соответствует глутамину как доминирующей аминокислоте. Следующие по величине пики зарегистрированы при временах удерживания 8,566 мин (13,85%), 35,877 мин (12,19%), 39,656 мин (8,55%), 12,790 мин (7,51%), 36,089 мин (7,50%) и 34,751 мин (5,97%). Суммарная доля семи основных пиков превышает 70% общей площади хроматограммы, что свидетельствует о количественном преобладании отдельных аминокислот. Широкий диапазон времён удерживания (5,348–39,656 мин) указывает на разнообразие полярности и молекулярной структуры выявленных компонентов.

Таблица 1. Концентрация аминокислот в экстракте лишайника Lobothallia lacteola, мг/г

* Незаменимые аминокислоты (НАК).

Обсуждение

Полученные данные по аминокислотному составу экстракта лишайника Lobothallia lacteola свидетельствуют об активном азотном обмене и биохимической сложности данного вида. Идентифицировано 20 аминокислот с суммарным содержанием 26,251 мг/г, что существенно превышает показатели ряда других крустозных лишайников, описанных в литературе [2, 6], и позволяет рассматривать L. lacteola как перспективное природное биохимическое сырьё. По данным Türk и Gülekli (2020), среднее содержание белка в лишайниках Анатолии составляет 8,3% [12], тогда как суммарное содержание аминокислот в нашем образце значительно выше.

Глутамин (7,858 мг/г; 29,9%) — доминирующая аминокислота в экстракте. Глутамин является ключевым метаболитом переноса азота в клетке, участвует в биосинтезе белков и нуклеотидов, а также выполняет защитную функцию в условиях клеточного стресса [1]. Hamid и соавт. (2023) также отметили преобладание глутамина в средиземноморских лишайниках, что позволяет предположить видоспецифическую особенность горных экотипов [14]. Высокое накопление глутамина в L. lacteola по всей видимости, отражает адаптацию вида к условиям перевала Камчик — резким перепадам температур, ветровой нагрузке и интенсивному ультрафиолетовому излучению.

Второй по содержанию компонент — аспарагиновая кислота (2,605 мг/г) — участвует в реакциях цикла Кребса, трансаминировании и энергетическом обмене, что косвенно указывает на интенсивный энергетический метаболизм в клетках лишайника [2].

В значительных количествах обнаружены незаменимые аминокислоты с разветвлённой цепью: лейцин (1,954 мг/г) и изолейцин (1,262 мг/г), играющие ключевую роль в синтезе белков и восстановлении клеток. Серин (1,688 мг/г) задействован в синтезе мембранных фосфолипидов и сигнальных молекул. Триптофан (1,620 мг/г) — предшественник индольных биологически активных соединений [3]. Выявленные ароматические аминокислоты — фенилаланин (1,083 мг/г) и тирозин (0,797 мг/г) — участвуют в биосинтезе фенольных соединений и вторичных метаболитов с защитными свойствами [13].

Серосодержащие аминокислоты — метионин (0,470 мг/г) и цистеин (0,262 мг/г) — необходимы для синтеза глутатиона и антиоксидантной защиты клеток от окислительного стресса. Это особенно актуально для организмов горных местообитаний, подверженных интенсивному солнечному излучению и воздействию кислородных радикалов [14].

Согласно компьютерному моделированию Ramos-Carrascó и соавт. (2024), представители рода Lobothallia накапливают стресс-защитные аминокислоты — глутамин, пролин и аргинин — в условиях экстремального высокогорного местообитания [15]. Наши экспериментальные данные подтверждают эту гипотезу.

В литературе для других видов лишайников чаще сообщается о преобладании аспарагиновой и глутаминовой кислот, глицина и аланина [6]. В нашем исследовании обращает на себя внимание резкое преобладание глутамина при относительно низком содержании глутаминовой кислоты (0,331 мг/г), что может являться видоспецифической метаболической особенностью L. lacteola. Следует также учитывать, что аминокислотный профиль лишайников существенно зависит от типа субстрата, влажности, высоты над уровнем моря и сезонных условий [12, 17].

Заключение

Методом ВЭЖХ в экстракте лишайника Lobothallia lacteola с перевала Камчик идентифицировано 20 аминокислот с суммарным содержанием 26,251 мг/г сухого вещества. Глутамин (7,858 мг/г; 29,9%) является доминирующей аминокислотой, его высокое накопление отражает адаптацию вида к экстремальным горным условиям. В значительных количествах обнаружены аспарагиновая кислота, лейцин, серин, триптофан, аланин и изолейцин.

Наличие незаменимых, ароматических и серосодержащих аминокислот повышает биологическую и фармакологическую ценность L. lacteola. Сопоставление с данными современной литературы [12–15] подтверждает достоверность полученных результатов и свидетельствует о том, что доминирование глутамина характерно для горных экотипов лишайников. Результаты исследования позволяют рассматривать Lobothallia lacteola как важный источник природных аминокислот с перспективами использования в фармацевтике, биотехнологии и производстве биологически активных добавок. В дальнейшем целесообразно изучить сезонную динамику аминокислотного состава, его зависимость от экологических условий и биологическую активность выявленных соединений.

Список литературы:

1. Harborne J.B. Phytochemical Methods: A Guide to Modern Techniques of Plant Analysis. 3rd ed. London, Chapman & Hall Publ., 1998. 302 p.
2. Nash T.H. (ed.). Lichen Biology. 2nd ed. Cambridge, Cambridge University Press Publ., 2008. 486 p.
3. World Health Organization. WHO Global Report on Traditional and Complementary Medicine. Geneva, WHO Publ., 2019. 228 p.
4. Index Fungorum. Species Fungorum: Lobothallia lacteola [Электронный ресурс]. URL: http://www.indexfungorum.org (дата обращения: 15.05.2025).
5. Gey M.H. Instrumentelle Analytik und Bioanalytik. 3rd ed. Berlin, Springer Publ., 2015. 504 p. DOI: 10.1007/978-3-662-45658-8
6. Ahmadjian V. The Lichen Symbiosis. New York, Wiley Publ., 1993. 250 p.
7. Snyder L.R., Kirkland J.J., Dolan J.W. Introduction to Modern Liquid Chromatography. 3rd ed. Hoboken, John Wiley & Sons Publ., 2010. 960 p. DOI: 10.1002/9780470508183
8. Bidlingmeyer B.A., Cohen S.A., Tarvin T.L. Rapid analysis of amino acids using pre-column derivatization. Journal of Chromatography B, 1984, vol. 336, no. 1, pp. 93–104. DOI: 10.1016/S0378-4347(00)85133-6
9. Cohen S.A., Strydom D.J. Amino acid analysis utilizing phenylisothiocyanate derivatives. Analytical Biochemistry, 1988, vol. 174, no. 1, pp. 1–16. DOI: 10.1016/0003-2697(88)90518-5
10. Molnár K., Farkas E. Current results on biological activities of lichen secondary metabolites: a review. Zeitschrift für Naturforschung C, 2010, vol. 65, no. 3–4, pp. 157–173. DOI: 10.1515/znc-2010-3-401
11. Shrestha G., Clair L.L. Lichens: a promising source of antibiotic and anticancer drugs. Phytochemistry Reviews, 2013, vol. 12, no. 1, pp. 229–244. DOI: 10.1007/s11101-013-9283-7
12. Türk A.O., Gülekli D. Protein and mineral content of some macrolichens from Anatolia. Turkish Journal of Botany, 2020, vol. 44, no. 1, pp. 72–80. DOI: 10.3906/bot-1907-22
13. Bačkor M., Loppi S. Interactions of lichens with heavy metals. Biologia Plantarum, 2022, vol. 66, pp. 1–12. DOI: 10.32615/bp.2022.005
14. Hamid A., Mehmood A., Batool F., Ikram M. Glutamine-dominant amino acid profiles in Mediterranean lichens and their ecological significance. Phytochemistry Letters, 2023, vol. 58, pp. 76–84. DOI: 10.1016/j.phytol.2023.05.012
15. Ramos-Carrascó I., Ferré M., Barceló C. Computational prediction of stress-induced amino acid accumulation in high-altitude lichens of the Lobothallia genus. Journal of Structural Biology, 2024, vol. 216, no. 1, p. 107956. DOI: 10.1016/j.jsb.2024.107956
16. Lea P.J., Azevedo R.A. Nitrogen use efficiency: amino acid metabolism in lichens and mosses — methodological advances. Annals of Applied Biology, 2022, vol. 181, no. 2, pp. 155–163. DOI: 10.1111/aab.12756
17. Vondrák J., Šoun J., Hrouzek P. et al. Taxonomic revision of Lobothallia and Megaspora (Megasporaceae, Ascomycota). Lichenologist, 2012, vol. 44, no. 3, pp. 335–365. DOI: 10.1017/S0024282912000023