КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АГЛИКОНОВЫХ ФЛАВОНОИДОВ Tripleurospermum disciforme ФЛОРЫ УЗБЕКИСТАНА

АННОТАЦИЯ

В статье представлены результаты определения агликоновых флавоноидов в экстрактах Tripleurospermum disciforme с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Исследуемые флавоноиды включали мирицетин, лютеолин, апигенин, кверцетин и кемпферол. Спиртовой экстракт цветков растения подвергали последовательному фракционированию на силикагеле с использованием экстракционного бензина и смеси хлороформ–метанол (9:1). Для одновременного количественного анализа соединений разработан быстрый и воспроизводимый метод ВЭЖХ с применением колонки Shim-pack GIST C18 (4,6×250 мм) в изократическом режиме (40% ацетонитрил в 0,05% ортофосфорной кислоте, скорость потока 0,8 мл/мин, детектирование при 254 нм). Метод показал высокую линейную корреляцию (r²≥0,999) в диапазоне концентраций 0,20–2,00 мг/мл, время анализа составляло 10 мин. Установлено, что цветки T. disciforme содержат 0,065% мирицетина, 0,092% лютеолина, 0,071% апигенина, 0,032% кверцетина и 0,011% кемпферола (в пересчёте на сухую массу).

ABSTRACT

The article presents the results of determination of aglycone flavonoids in Tripleurospermum disciforme extracts using high-performance liquid chromatography (HPLC). The studied flavonoids included myricetin, luteolin, apigenin, quercetin, and kaempferol. The ethanol extract of the plant flowers was subjected to sequential fractionation on silica gel using extraction gasoline and a chloroform-methanol mixture (9:1). For simultaneous quantitative analysis of the compounds, a rapid and reproducible HPLC method was developed using a Shim-pack GIST C18 column (4.6 × 250 mm) in the isocratic mode (40% acetonitrile in 0.05% orthophosphoric acid, flow rate 0.8 ml/min, detection at 254 nm). The method showed a high linear correlation (r²≥0.999) in the concentration range of 0.20–2.00 mg/ml, the analysis time was 10 min. It was found that T. disciforme flowers contain 0.065% myricetin, 0.092% luteolin, 0.071% apigenin, 0.032% quercetin and 0.011% kaempferol (calculated on dry weight).

Ключевые слова: Tripleurospermum disciforme Sch. Bip, высокоэффективная жидкостная хроматография, флавоны, флавонолы, кемпферол, кверцетин, мирицетин, апигенин, лютеолин.

Keywords: Tripleurospermum disciforme Sch. Bip, high performance liquid chromatography, flavones, flavonols, kaempferol, quercetin, myricetin, apigenin, luteolin.

В настояшее время Узбекистан является одной из стран мира, богатой лекарственными растениями, что обосновывает целесообразность их фитохимического исследования. Народная медицина издавна использовала сотни растений для лечения заболеваний из-за их сниженных побочных эффектов, экономической эффективности и свободной доступности [1]. Заслуживающие внимания научные вклады были сделаны по различным аспектам растения рода Tripleurospermum L., таким как его фармакологические [2], токсикологические [2], биохимические свойства вторичных метаболитов, фармацевтическая оценка белков и пептидов, полученных из этого растения [3].

Род Tripleurospermum Sch. Bip. принадлежит к семейству Asteraceae (Compositae), трибе Anthemideae и представлен примерно 40 видами [4-6]. Во флоре Узбекистана произрастает два вида Tripleurospermum [7].

Tripleurospermum disciforme - Трёхрёберник дисковидный, является широко распространенным двулетним видом, который можно встретить практически везде на сельскохозяйственных угодьях и в садах как сорняк. Данный вид трёхрёберника широко распространен на мелкоземистых склонах, сырых местах в среднем поясе гор, иногда как отмечено сорничает близ жилья. В Узбекистане данный вид произрастает в Джизакской, Самаркандской и Сурхандарьинской областях [7].

Экстракты этого растения показывают превосходную антиоксидантную активность, также его сырой экстракт показывает значительную противогрибковую активность in vitro против нескольких штаммов грибков [8,9].

В результате проведенных фитохимических исследований установлено, что Tripleurospermum disciforme продуцирует биологически активные терпеноиды и флавоноиды [10-12].

В последнее время, за счет совершенствования техники метод высокоэффективной жидкостной хроматоргафии (ВЭЖХ) стал одним из распространенных и широко используемых в области фитохимии, и активно применяется для анализа вторичных метаболитов, а именно, терпеноидов, фенольных соединений и алкалоидов [13-16].

В связи с этим, целью настоящей работы являлась разработка метода ВЭЖХ и анализ флавоноидов с целью количественного определения в цветочных корзинках Tripleurospermum disciforme, произрастающего в Узбекистане.

Материалы и методы

Для проведения анализа использовали траву Tripleurospermum disciforme, собранную в Джизакской области, Бахмальского района в первой декаде июля 2024 года. Видовую принадлежность определяли сопоставлением собранного гербарного образца с гербарным материалом Tripleurospermum disciforme, хранящимся в Центральном гербарии Узбекистана.

Качественную и количественную идентификацию флавоноидов на хроматограммах в процессе ВЭЖХ анализа проводили сопоставлением времен удерживания (ВУ) стандартных образцов и содержащих их проб в аналогичных условиях.

Для получения анализируемого образца из цветков трёхрёберника дисковидного, 500 г сухих и измельченных цветков помешали в патрон из фильтровальной бумаги и экстрагировали в аппарате Сокслета 95%-ным этиловым спиртом в течение 4 часов. Полученный экстракт сгущали на роторном испарителе до минимального объёма и смешивали с силикагелем КСК в соотношении 1:1.2 (вес-вес) и помещали на хроматографическую колонку. Далее вымывали экстракционным бензином для удаления липидоподобных веществ и летучих компонентов, затем проводили элюирование в смеси хлороформ-метанол в соттношении 9:1. Полноту выделения определяли при помощи тонкослойной хроматографии (ТСХ) (проявитель пары аммиака). Далее полученную хлороформ-метанольную фракцию высушивали и в результате получили 8.45 г образцу.

ВЭЖХ анализ проводили на хроматографе Shimadzu LC-20AD (Япония), DGU-20A 5R, градиентным смесителем, детектором с переменной длиной волны (VWD) SPD-20A и петлевым инжектором с петлей на 20 мкл в следующих условиях: колонка Shim-packGISTC18 (Shimadzu, Япония) (4.6250 мм) с размером частиц 5 мкм оснащенной предколонкой Shim-pack GISTC18 (1050мм (G), Shimadzu, Япония), изократический режим, состав мобильной фазы: - 40% ацетонитрил (Chromasolv R, Sigma, Германия, содержание ацетонитрила по ГХ не менее 99.9%, пропускание при 220 нм не менее 90%) в 0.05 % водном растворе ортофосфорной кислоты рН 2.5, скорость потока 0.8 мл/мин., детектирование – спектрофотометрически при 254 нм. Объем образца 20 мкл. Время анализа составлял не более 15 мин.

Для проведения анализа использовали рабочие стандартные образцы (РСО) флавонолов мирицетина (1), кверцетина (4), кемпферола (5), и флавонов лютеолина (2), апигенина (3), соответствующей чистоты, подтвержденных спектральными методами.

Приготовление растворов стандартных образцов.

Навески по 5 мг РСО (точная навеска) флавонолов и флавонов, количественно отвесили на аналитических весах, поместили в мерную колбу объемом 5 мл и растворили в ацетонитриле для жидкостной хроматографии.

Точную навеску 10 мг сухого исследуемого образца (упаривали до постоянной массы), взвешенную на аналитических весах, растворяли в ацетонитриле для анализа при легком нагревании на водяной бане в таком объеме, чтобы конечная концентрация вещества была 5 мг/мл и фильтровали через мембранный фильтр с размером пор 0.22 мкм в специализированные флаконы для ВЭЖХ анализа. Анализ ВЭЖХ проводили в условиях, аналогичных анализу стандартных растворов.

Результаты и их обсуждение

Хроматографический анализ показал наличие пиков исследуемого образца хлороформной и этилацетатной фракций спиртового экстракта травы Tripleurospermum disciforme, сходного по ВУ с пиками РСО образцами (Рис.1).

В результате проведенных исследований установлено, что в хлороформной и этилацетаной фракции спиртового экстракта цветков и листьев Tripleurospermum disciforme содержатся агликоновые флавоноиды, такие, как мирицетин (1), лютеолин (2), апигенин (3), кверцетин (4) и кемпферол (5), количественное содержание которых приводится в таблице 1.

Рисунок 1. ВЭЖХ хроматограмма анализируемой фракции трёхрёберника дисковидного

При проведении исследования установлено, что ВУ флавонолов мирицетина (1), кверцетина (4), кемпферола (5) и флавонов лютеолина (2), апигенина (3) в стандартах и аналитической пробе составляет ВУ=7.319 мин., ВУ=9.284 мин., ВУ=10.712 мин., ВУ=11.626 мин. и ВУ=14.913 мин., с отклонением в обе стороны <1%. Пики примесей растворителя и фоновых веществ не мешали при определении этих агликоновых флавоноидов.

Таблица 1.

Результаты количественного анализа флавоноидов в анализируемой фракции этанольного экстракта трёхрёберника дисковидного, идентифицированного методом ВЭЖХ

* – время удерживания; ** – от воздушно весового сырья.

Заключение

В результате количественного анализа экстракта трёхрёберника дисковидного с помощью ВЭЖХ установлено, что содержание агликоновых флавонолов мирицетина (1), кверцетина (4), кемпферола (5) и флавонов лютеолина (2), апигенин (3) в сырье составляло не менее 0.271%. Разработанная методика количественного определения этих веществ может быть использована для стандартизации травы Tripleurospermum disciforme. Показано, что методика ВЭЖХ анализа позволяет осуществлять одновременное количественное определение таких флавоноидов в смеси хлороформ-метанол (9:1) во фракциях, полученных из спиртового экстракта и обладает простотой, экспрессностью и хорошей воспроизводимостью.

Необходимо отметить, что цветки и листья трёхрёберника дисковидного являются перспективными источниками биологически активных флавоноидов: кемпферола, кверцетина, мирицетина, апигенина и лютеолина.

Список литературы:

1. Zebarjadi A., Ahmadvandi H.R., Kahrizi, D., Cheghamirza K. Assessment of Genetic Diversity by Application of Inter Simple Sequence Repeat (ISSR) Primers on Iranian Harmal (Peganum harmala L.) Germplasm as an Important Medicinal Plant // Journal of Applied Biotechnology Reports. –2016. –3. –P. 441-445.
2. Chen M., He X., Sun H., Sun Y., Li L., Zhu J., Xia G.,Guo X.,Zang H. Phytochemical analysis, UPLC-ESI-Orbitrap-MSanalysis, biological activity, and toxicity of extracts from Tripleurospermum limosum (Maxim.) Pobed // Arabian Journal of Chemistry. – 2022.– Vol.15.– P. 103797.
3. Garcia S.,Inceer H.,Garnatje T., Valles J. Genome size variation in some representatives of the genus Tripleurospermum // Biologia Plantarum. – 2005. –Vol. 49.– P. 381-387.
4. Mabberley D.J. The Plant Book, A Portable Dictionary of the Higher Plants, Cambridge University Press, Cambridge.– 1990. –P. 592.
5. Goula K., Chiotelis Ch., Constantinidis Th. Tripleurospermum parviflorum (Asteraceae): a new record for the flora of Greece // Hacquetia. – 2025. – Vol. 24/2. – P. 207-212.
6. Ramezanali Aliakbar M., Pakravan M., Sonboli A., Khayati M. Three new records of Tripleurospermum (Asteraceae) for the flora of Iran // Iranian Journal Of Botany. – 2021. – 27 (1). – P. 31-41.
7. ФлораУзбекистана. Ташкент: изд-во АН УзССР,  Т.6.  С. 124.
8. Souri E., Sarkhail P., Kaymanesh P., Amini M., Farsam H.Antioxidant Activity of Extract and a New Isolated Dioxaspiran Derivative of Tripleurospermum disciforme // Pharmaceutical Biology. – 2005. – Vol.43. – P.620-623.
9. Amin G., Dehmoobed-Sharifabadi A., Salehi Surmaghi M.S., Yasa N., Aynechi Y., Emami M., Shidfar M., Amin M., Moghadami M., Kordbacheh P., Zeini F. Screening of Iranian Plants for Antifungal Activity // Daru Journal of Pharmaceutical Science. – 2002. – Vol.10, – P. 38-48.
10. Javidnia K., Miri R.,Soltani M., Khosravi A.R. Essential oil composition of Tripleurospermum disciforme from Iran // Chemistry of Natural Compounds. – 2008. – Vol. 44. - P. 800-801.
11. Sheydaei P., DuarteA.P. The Genus Tripleurospermum Sch. Bip. (Asteraceae): A Comprehensive Review of Its Ethnobotanical Utilizations, Pharmacology, Phytochemistry, and Toxicity // Life. – 2023. – Vol. 13, – P. 1323.
12. Kurkcuoglu M., Tosun F., Inceer H., Husnu Can Baser K. Volatile compounds of Tripleurospermum decipiensfrom two natural populations inTurkey // Chemistry of Natural Compounds. – 2019. – Vol. 55. – P. 565-567.
13. Azzahra A.J., Sagala B.C., Anisa M.A., Kamilah S. Analysis of secondary metabolyte compounds in medicinal plant extracts using HPLC method // MIDWINERSLION Jurnal Kesehatan STIKes Buleleng. –2024, – Vol. 9 (1).–P. 151-160.
14. Sharma, R., Chaudhary, A., Sharma, Y.P., Kumar, S. Plant Secondary Metabolite Determination Through Analytical Chromatographic Techniques: Recent Trends and Advancement. – 2022. Springer, Singapore. – P. 479.
15. Mayasar Al-Zaban, Souheila Naghmouchi, Nada K. Al Harbi HPLC-Analysis, Biological Activities and Characterization of Action Mode of Saudi Marrubium vulgare against Foodborne Diseases Bacteria // Molecules. – 2021. – 26. – P. 5112.
16. Hammad Saleem, Thet Thet Htar, Rakesh Naidu, Sirajudheen Anwar, Gokhan Zengin, Marcello Locatelli, Nafees Ahemad HPLC–PDA Polyphenolic Quantification, UHPLC–MS Secondary Metabolite Composition, and In Vitro Enzyme Inhibition Potential of Bougainvillea glabra // Plants. – 2020. – 9. – P. 388.