ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА ЭКСТРАКТОВ НЕКОТОРЫХ ЛИШАЙНИКОВ

АННОТАЦИЯ

В данной статье представлены сведения о получении экстрактов лишайников типа «Rhizoplaca chrysoleusa», «Dermatocarpon miniatum linnaeus», «Peltigera canina linnaeus» и изучении их химического состава. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) изучено содержание полифенольных соединений (кверцетин, апигенин, кемпферол) и витаминов (В₁, В₂, В₉, В₁₂, С и PP) в экстрактах лишайников. В результате установлено, что хроматограмма экстракта растений «Rhizoplaca chrysoleuca», «Dermatocarpon miniatum linnaeus», «Peltigera canina linnaeus» содержала компоненты, соответствующие срокам хранения стандартных образцов соответствующих витаминов и фенольных соединений.

ABSTRACT

This article presents information on obtaining lichen extracts of the types "Rhizoplaca chrysoleusa", "Dermatocarpon miniatum linnaeus", "Peltigera canina linnaeus" and studying their chemical composition. The content of polyphenolic compounds (quercetin, apigenin, kaempferol) and vitamins (V1, V2, V9, V12, S and PP) in lichen extracts was studied using high-performance liquid chromatography (HPLC). As a result, it was established that the chromatogram of the extract of the plants "Rhizoplaca chrysoleuca", "Dermatocarpon miniatum linnaeus", "Peltigera canina linnaeus" contained components corresponding to the shelf life of standard samples of the corresponding vitamins and phenolic compounds.

Ключевые слова: Rhizoplaca chrysoleuca, Dermatocarpon miniatum linnaeus, Peltigera canina linnaeus, экстракт, флавоноиды, витамины, метод ВЭЖХ.

Keywords: Rhizoplaca chrysoleuca, Dermatocarpon miniatum linnaeus, Peltigera canina linnaeus, extract, flavonoids, vitamins, HPLC method.

Введение

Лишайники – это особая группа грибов, комплексы живых организмов, состоящие из водорослей и грибов. Химический состав лишайников также довольно сложен, и они содержат большое количество хитина, лишайникового крахмала, лихенин, дисахарида сахарозы, различных ферментов, таких как амилаза, много аминокислот и витаминов С, В6, В12 и др. [2; 5]. Среди лишайников, встречающихся в нашей стране, уникальными характеристиками обладают «Rhizoplaca chrysoleuca», «Dermatocarpon miniatum linnaeus», «Peltigera canina linnaeus».

«Rhizoplaca chrysoleuca» – бледно-желто-зеленый или серо-зеленый пупочный листовой лишайник семейства Lecanoraceae.

«Dermatocarpon miniatum linnaeus» имеет листовидную структуру, диаметром до 6 см, монофилетичный, состоящий из одного или нескольких цельных или нерегулярно рассеченных синих листьев, которые в летние месяцы становятся серыми. Лишайник «Peltigera canina Linnaeus» среднего размера, длиной 30–150 мм, круглый, листовидной формы, широко распространен по всей территории России, Евразии, Африки, Северной и Южной Америки, Австралии, Центральной Азии и в среднем течении бассейна река Зарафшана [1; 8].

Лишайники богаты несколькими вторичными метаболитами, включая алкалоиды, терпеноиды, фенольные соединения, в том числе гликозиды, флавоноиды, стероиды и танины [3; 4]. Флавоноиды – это фенольные соединения, встречающиеся в растениях, особенно в овощах и фруктах, их семенах, стеблях и листьях [10; 13; 14]. В настоящее время идентифицировано более 7000 флавоноидов, которые считаются лекарственными веществами, оказывающими благотворное влияние на здоровье человека, особенно благодаря их антиоксидантным и нейтрализующим свободные радикалы эффектам [6; 7; 11; 12].

Лечебные свойства лишайников связаны с их химическим составом, то есть наличием алкалоидов, флавоноидов, витаминов, углеводов и других биологически активных веществ. Химический состав и лечебные свойства лишайников в нашей стране до настоящего времени не изучались, поэтому расширение исследований в этой области, разработка новых видов лекарственных средств, изучение их химического состава [8; 9; 11], а также изучение структур полученных соединений на основе современных физико-химических методов и изучение их биологической активности являются актуальными задачами современной химии.

Целью данной работы является изучение химического состава экстрактов лишайников «Rhizoplaca chrysoleuca», «Dermatocarpon miniatum linnaeus», «Peltigera canina linnaeus», выделение витаминов и полифенольных соединений из экстракта лишайника, а также изучение физико-химических свойств выделенного вещества.

Экспериментальная часть

Использованные реагенты и методы. В качестве растворителей для исследовательской работы использовались 96 % и 70 % этанол. В качестве реагентов (к.т.) использовались 100 % чистая (бидистиллятная) вода, ацетонитрил, химически чистая уксусная кислота и гидроксид натрия.

Образцы растений «Rhizoplaca chrysoleuca», «Dermatocarpon miniatum linnaeus», «Peltigera canina linnaeus» смешивали с 20 мл этилового спирта в ультразвуковой ванне (марка GT SONIC-D3 (Китай)) и экстрагировали с помощью магнитной мешалки при температуре 30°С в течение 75 минут. Процесс непрерывного перемешивания смесей осуществлялся в магнитной мешалке (модель ММ-5 ТУ 25-11834-80). Затем центрифугировали на центрифуге Mini-7 (BIOBASE, Китай) со скоростью 7000 об/мин. Использовались аналитические весы (OHAUS (США) NV222) с точностью 0,01 г. Содержание витаминов и полифенолов в растении определяли с помощью высокоэффективного жидкостного хроматографа (LC 2030 C 3D Plus, Shimadzu, Япония).

Обсуждение полученных результатов

В исследовании использовался описываемый ниже метод качественного и количественного определения флавоноидов, содержащихся в тонкоизмельченных образцах лишайников: «Rhizoplaca chrysoleuca», «Dermatocarpon miniatum linnaeus», «Peltigera canina linnaeus».

Для извлечения определяемых веществ из образца в качестве растворителя использовался 70 % этиловый спирт. Для этого 1 грамм образца смешивали с 20 мл спирта и экстрагировали с помощью магнитной мешалки при температуре 30°С в течение 75 минут. Количество рутина, галловой кислоты и кверцетина в образцах определяли с использованием картриджа (Agilent Zorbax 4,6 мм ID x 12,5 мм) и колонки (Perkin Elmer C18 250x4,6 мм) 5 мкм C18 (США) в качестве неподвижной фазы. Для этого готовили растворы 0,5 % раствора уксусной кислоты и стандартных растворов в ацетонитриле с различной концентрацией: 0,025 мг/мл и 0,05 мг/мл и анализировали в градиентном режиме в течение 18 минут при скорости потока 0,8 мл/мин, исходя из температуры термостата 40 ⁰С. В результате хроматографического анализа состава экстракта получены следующие результаты (рис.1).

Рисунок 1. Хроматограмма флавоноидов в экстракте растения «Rhizoplaca chrysoleuca»

Хроматограммы выделенных веществ сравнивали с хроматограммами, полученными из стандартных образцов (рис.2).

Рисунок 2. Хроматограмма флавоноидов, полученных из стандартных образцов

При анализе количества флавоноидов, извлеченных из образцов лишайников «Rhizoplaca chrysoleuca», «Peltigera canina linnaeus», «Dermatocarpon miniatum linnaeus» установлено, что в составе «Peltigera canina linnaeus» содержатся физиологически активные соединения кверцетин (557,86 мг/кг) и кемпферол (316,2 мг/кг). Рутин, галловая кислота и апигенины не обнаружены. Экстракт лишайника «Rhizoplaca chrysoleuca» содержит большее количество галловой кислоты (109,87) и рутина (132,76) по сравнению с кверцетином (31,80), апигенином (13,60) и кемпферолом (14,10). Физиологически активными соединениями, обнаруженными в «Dermatocarpon miniatum linnaeus», были кверцетин (2066,06 мг/кг), апигенин (796,9 мг/кг) и кемпферол (349,12 мг/кг), но рутин и галловая кислота не были обнаружены (таблица 1).

Таблица 1.

Содержание флавоноидов в экстракте (мг/100 г сухого веса)

Поскольку в растительном экстракте наряду с фенольными соединениями растворялись и водорастворимые витамины, в спектре наблюдались также спектры поглощения, характерные для витаминов (В₆, РР, В₁₂, В₂), что определялось путем сравнения с хроматограммой стандарта витамина. Качественные и количественные показатели витаминов B₁, B₂ , B₆​​, витамина B₉, B₁₂, C и PP в тонкоизмельченных образцах определяли с помощью прибора ВЭЖХ (LC 2030 C 3D Plus производства (Shimadzu, Япония) с детектором PDA на выбранных длинах волн 260, 290 и 361 нм на основе стандартных образцов (фирмы Sigma Aldrich Германия). В качестве неподвижной фазы использовали колонку C18 250x4,6 мм 5 мкм (Perkin Elmer) из США. Анализ витаминов проводился с использованием 0,5 % раствора уксусной кислоты в качестве подвижной фазы, фазы А и ацетонитрила в качестве подвижной фазы в чередующемся режиме (табл.2).

Таблица 2.

Режим изменения фазы для анализа витаминов

Скорость потока составляла 1 мл/мин, температура термостата – 400°С, объем вводимой пробы – 10 мкл, время анализа – 14 минут.

Проба, взятую для извлечения содержащихся в ней витаминов, взвешивали на аналитических весах 1 г с точностью 0,001 мг. Затем его обрабатывали 20 мл 0,1 н раствора соляной кислоты, перемешивали в течение 60 мин. при 121 ⁰С на магнитной мешалке, затем раствор центрифугировали при 12000 об/мин в течение 10 мин, фильтровали через фильтр 0,45 мкм и помещали во флакон. После подготовки образцов были получены следующие хроматограммы (рисунки 3–4).

Рисунок 3. Хроматограмма стандартных образцов витаминов В₁, В₂, В₆, В₉, В₁₂, С и РР

Концентрированные экстракты количественно анализировались в ВЭЖХ. В экстракте «Rhizoplaca chrysoleuca» определено количество витаминов В₁ (18,72 мг/кг), В₂ (5,26 мг/кг), В₆ (43,79 мг/кг), при этом установлено, что экстракт не содержит витаминов В₁₂ и В₉, РР и С.

В экстракте «Peltigera canina linnaeus» определялось наличие и количество витаминов В₁ (23,96 мг/кг), В₂ (11,72 мг/кг), В₉ (218,72 мг/кг), В₁₂ (48,92 мг/кг), С (258,9 мг/кг) и РР (157,36 мг/кг), однако витамин В6 в экстракте не обнаружен.

В экстракте «Dermatocarpon miniatum linnaeus» определяли наличие и количество витаминов В₂ (107,24 мг/кг), В₉ (66,076 мг/кг), В₁₂ (62,96 мг/кг), С (644,06 мг/кг), РР (966,1 мг/кг), при этом обнаружено, что экстракт не содержит витаминов В1 и В6. Установлено, что наибольшее количество витаминов в составе «Dermatocarpon miniatum linnaeus» составляют витамины РР и С (табл. 3).

Таблица 3.

Содержание витаминов в экстракте (мг/100 г сухого веса)

Рисунок 4. Хроматограмма витаминов в экстракте растения «Dermatocarpon miniatum linnaeus»

Заключение

При изучении химического состава экстрактов образца лишайника “Rhizoplaca chrysoleuca” установлено, что в экстрактах растения содержится больше количество галловой кислоты (109,87) и рутина (132,76) по сравнению с кверцетином (31,80), апигенином (13,60) и кемпферолом (14,10) на 100 грамм образца. В экстракте «Dermatocarpon miniatum linnaeus» обнаружено кверцетин (2066,06 мг/кг), апигенин (796,9 мг/кг) и кемпферол (349,12 мг/кг), однако рутин и галловая кислота не были обнаружены. Зафиксировано, что кверцетин (557,86 мг/кг) и кемпферол (316,2 мг/кг) содержится в большем количестве в «Peltigera canina linnaeus», рутин, галловая кислота и апигенины не присутствуют на 100 грамм образца. Разработана методика определения количественного содержания витаминов В₁, В₂, В₉, В₁₂, С и РР в экстракте образцов лишайников.

Список литературы:

1. Андреев М.П., Котлов Ю.В., Макарова И.И.  Биологическое разнообразие лишайников Русской Арктики (таксономический состав и предварительный анализ) // Новости систематики низших растений. – Т. 31. – 1996. – С. 82–94.
2. Гуларьянц Г. Хрупкий мир лишайников // Наука и жизнь. – 2017. – № 11. – С. 112–117.
3. Пауков А.Г., Трапезникова С.Н.  Новые для флоры Урала виды литофильных лишайников // Ботанический журнал. – 2003. – Т. 88. – № 2. – С. 104–109.
4. Селиванов А.Е. Лишайники заповедников «Басеги» и «Вишерский» (Пермская область) // Новости систематики низших растений. – 2005. – Т. 38.
5. Флора лишайников России: Биология, экология, разнообразие, распространение и методы изучения лишайников / отв. ред. М.П. Андреев, Д.Е. Гимельбрант. – М.; СПб.: Товарищество научных изданий КМК. – 2014. – 392 с.
6. Arora S., Itankar P. Extraction, isolation and identification of flavonoid from Chenopodium album aerial parts // JTCM. – 2018. – Vol. 8. – Pp. 476–482.
7. De Villiers A., Venter P. Pasch H. Recent advances and trends in the liquid-chromatography-mass spectrometry analysis of flavonoids // Journal of Chromatography A. – 2016. – Vol. 1430. – Pp. 16–78.
8. Ismoilova Sh.S.,  Abdurakhmanova U.K. Determination of vitamins in the composition of extracts of lichenes “Dermatocarpon miniatum linnaeus” and  “Peltigera canina linnaeus” // Science and innovation international scientific journal. – Vol. 3(12). – 2024. – С. 117–121.
9. Ismoilova Sh.S., Abduraxmanova U.K.,  Norkulov M.M.  Dermatocarpon  Miniatum(L.)  W.Mann.,  va  “Peltigera Canina(L.)  Willd.  turlari  ekstraktining  kimyoviy tarkibini miqdoriy o‘rganish // SamDU Ilmiy axborotnomasi. – 2024. № 5/1(147). – B.56–59.
10. Karabin M., Hudcova T., Jelinek L., Dostalek P. Biotransformation and biological activities of hop flavonoids // Biotechnology Advance. – 2015. – Vol. 33. – Pp. 1063–1090.
11. Olagaray K.E., Bradford B.J. Plant flavonoids to improve productivity of ruminants—A review // Animal Feed Science and Technology. – 2019. – Vol. 251. – Pp.  21–36.
12. Sharma V., Janmeda P. Extraction, isolation and identification of flavonoid from Euphorbia neriifolia leaves // AJC. – 2017. – Vol. 10. – Pp. 509–514.
13. Xu M.S., Chen S., Wang W.Q., Liu S.Q. Employing bifunctional enzymes for enhanced extraction of bioactives from plants: Flavonoids as an example // Journal of Agricultural Food Chemistry. – 2013. – Vol. 61. – Pp. 7941–7948.
14. Zuiter A.S., Zarqa J. Proanthocyanidin: Chemistry and biology: From phenolic compounds to proanthocyanidins // Reference Module in Chemistry, Molecular Sciences and Chemical Engineering; Reedijk, J., Ed.; – Elsevier: Amsterdam, 2014. – Pp.1–29.