МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ ГРИБЫ РОДА Aspergillus ПОСЛЕ ДОЛГИХ ЛЕТ ХРАНЕНИЯ МЕТОДОМ ЛИОФИЛИЗАЦИИ

АННОТАЦИЯ

Проведены исследования некоторых промышленно-важных микроскопических грибов рода Aspergillus коллекционного фонда Института микробиологии Академии наук Республики Узбекистан, которые хранятся в течение долгих лет методом лиофилизации. Показано, что метод лиофилизации является наиболее оптимальным для хранения микромицетов рода Aspergillus. При хранении этого метода культуры сохраняли жизнеспособность, морфолого-культуральные свойства и антагонистические способности к фитопатогену Verticillium dahliae.

ABSTRACT

Studies have been carried out on some industrially important microscopic fungi of the genus Aspergillus of the collection fund of the Institute of Microbiology of the Academy of Sciences of the Republic of Uzbekistan, which are stored for many years by lyophilization. It has been shown that the lyophilization method is the most optimal for the storage of micromycetes of the genus Aspergillus. When storing this method, cultures retained viability, morphological and cultural properties and antagonistic abilities to the phytopathogen Verticillium dahliae.

Ключевые слова: микроскопические грибы, жизнеспособность, хранение, лиофилизация, Aspergillus.

Keywords: microscopic fungi, viability, storage, lyophilization, Aspergillus.

Введение

В работах отечественных и зарубежных авторов приводятся данные о различной устойчивости микроорганизмов при консервации. Жизнеспособность клеток является важным показателем, при использовании различных способов поддержания и сохранения микроорганизмов, которая оценивается в процентах по отношению к контролю [1; 2; 3].

Для эффективной и непрерывной работы очень важно поддержание культур в коллекции, поскольку при неправильном хранении микроорганизмы либо погибают, либо утрачивают свои физиологические свойства.

Музейные клетки микроорганизмов служат для сохранения депозитария и восстановления рабочей культуры в случае ее гибели. Для поддержания коллекции используются различные методы хранения культур микроорганизмов. К краткосрочным относятся субкультивирование или метод хранения на питательных средах и метод поддержки на образцах биоповреждаемых материалов. Краткосрочные методы используются как для рабочих, так и для музейных культур микроорганизмов. К долгосрочным методам относятся способы криогенного замораживания и лиофилизации. Долгосрочные технологии используются для музейных культур. 

Каждый из методов, описанных ранее, имеет свои достоинства и недостатки. Для хранения каждого штамма из коллекции обязательно используют как минимум один краткосрочный и один долгосрочный метод. Хранение наиболее ценных штаммов, обладающих наибольшей способностью к биоповреждениям материалов, производится всеми четырьмя методами. Именно сочетание различных способов хранения микроорганизмов деструкторов позволяет успешно проводить различные исследования и испытания при микробиологических повреждениях материалов и изделий [4].

Хранение культур микроорганизмов без потери необходимых качеств проводится методами, которые обеспечивают замедление жизненных процессов микробов. Довольно широкое распространение для криогенного замораживания биоматериала получил жидкий азот, который позволяет сохранять культуры при наиболее низких температурах – менее -153°С [5; 6;7].

В настоящее время 80% штаммов мицелиальных грибов заложено на хранение методом лиофильного высушивания. Выборочные проверки продемонстрировали сохранение жизнеспособности после 35 лет хранения, в частности, у представителей видов Rhizopus oryzae, Melanocarpus albomyces, Penicillium variabile, Clonostachys rosea F.catenulata, Thielavia terricola, Trichoderma viride и др. Криоконсервация проводится в защитных средах с оптимальной для каждой культуры скоростью охлаждения [8].

После 33 лет хранения в лиофилизированном состоянии сохранили жизнеспособность 14 штаммов грибов: рода Aspergillus niger (4 штамма), Aspergillus fumigates (3 штамма), Aspergillus ochraceus (3 штамма), Aspergillus oryzae (1 штамм), Fusarium sp. (2 штамма), Citromyces glaber (1 штамм). Погиб штамм Alternaria sp. 413 [9].

Спорообразующие культуры микроорганизмов хорошо переносят процессы высушивания лиофилизации и сохраняют жизнеспособность вместе с необходимыми важными признаками. В связи с этим, целью настоящего исследования является изучение влияния лиофилизации на жизнеспособность и сохранности физиологической активности коллекционных производственно-важных микроскопических грибов рода Aspergillus, после длительного хранения методом лиофилизации.

Объекты и методы исследования

Материалом для исследования послужили микроскопические грибы коллекционного фонда рода Aspergillus, выделенные из различных субстратов Узбекистана и сохраняемые в коллекции микроорганизмов Института микробиологии Академии наук Республики Узбекистан в течение длительного времени.

Для лиофильного высушивания использовали 7-суточные микроскопические грибы, выращенные на агаризованных элективных средах. Микромицеты смывали защитной средой, состоящей из 1,5% желатина, крахмала и тщательно встряхивали. Полученную суспензию каждой культуры разливали в пенициллиновые флаконы по 5 мл. Лиофилизацию культур осуществляли на установках «ALPHA 1-2 LDplus» и ТГ-50 с предварительным пристеночным замораживанием. После высушивания крышки бутылочек герметически укупоривали алюминиевыми колпачками или парафином [10].

Количество жизнеспособных клеток определяли методом предельных разведений с высевом на питательные среды. Посевы инкубировали от 2-5 суток, подсчитывали количество выросших колоний. Выживаемость культур изучали до лиофильного высушивания, после него и в процессе хранения.  Жизнеспособность оценивали в процентах по отношению к контролю.

Антагонистическую активность микроскопических грибов изучали методом агаровых блоков [11].

Результаты исследования

Проведены исследования некоторых промышленно-важных микроскопических грибов рода  Aspergillus коллекционного фонда Института микробиологии Академии наук Республики Узбекистан. Микроскопические грибы рода Aspergillus выделены из различных регионов Узбекистана, различных мест обитания, которые являются продуцентами биологически активных веществ, хранящиеся в течение долгих лет методом лиофилизации (табл.1). 

Жизнеспособность клеток является важным показателем, при использовании различных способов поддержания и сохранения микроорганизмов, оцениваемая по отношению к контролю. В ходе исследования изучена жизнеспособность промышленно-важных штаммов микроскопических грибов рода Aspergillus, при их хранении методом лиофилизации.

Таблица 1.

Промышленно-важные микроскопические грибы коллекционного фонда

Результаты показали, что все изученные штаммы микромицетов сохраняют жизнеспособность в лиофилизированном состоянии (табл. 2). При этом количество жизнеспособных клеток у штаммов Aspergillus awamorii 12 и Aspergillus niger 30 снижается на 1-2 порядка (10⁷, 10⁸), Aspergillus flavus 837 – 2,0х10⁸, Aspergillus oryzae 47 - 7,0х10⁸.

Таблица 2.

Жизнеспособность коллекционных штаммов грибов при хранении методом лиофилизации

Таким образом, с помощью таблиц показано, что изученные культуры хорошо переносят лиофилизацию и хранение в таком состоянии в течение 8 лет. При этом снижение количества жизнеспособных клеток у изученных штаммов в среднем составляет 1-2 порядка.

В последующих исследованиях изучены морфолого-культуральные свойства микромицетов, хранившихся методом лиофилизации в течение 8 лет. Авторами данной статьи показано, что все изученные культуры рода Aspergillus сохраняли морфолого-культуральные признаки (рис.1).

Рисунок 1. Морфолого-культуральные признаки микроскопических грибов рода Aspergillus после 8 лет хранения методом лиофилизации

При хранении микроорганизмов в лиофильно высушенном состоянии в их клетках происходят некоторые изменения, последствия которых, выявляются в течение культивирования культур в первом пассаже. После хранения выражаются в изменении количества жизнеспособных единиц, ингибировании или стимуляции процессов продукции антибиотиков, ферментов. В связи с этим, изучена антагонистическая способность микроскопических грибов рода Aspergillus после долгих лет хранении методом лиофилизации (рис. 2, табл. 3).

Рисунок 2. Ингибирование Verticillium dahliae микроскопическими грибами рода Aspergillus

Таблица 3.

Антагонистические способности микромицетов при хранении методом лиофилизации

Анализ сохранности антагонистической способности микроскопических грибов выявил, что все проверенные штаммы обладали активностью по отношению к фитопатогену Verticillium dahliae. Зона подавления роста патогена составляла от 25 до 36 мм в диаметре.

Таким образом, данное исследование показывает, что промышленно-важные микроскопические грибы рода Aspergillus при хранении методом лиофилизации культуры сохраняли морфолого-культуральные свойства и не теряют антагонистическую способность к фитопатогену Verticillium dahliae.

Выявления сохранности и изменчивости морфолого-культуральных, физиологических, биохимических показателей, высокой жизнеспособности микроорганизмов-продуцентов биологически активных соединений, являются практически важными показателями для рекомендации их теоретического, практического применения, использования в научных исследованиях, отраслях сельского хозяйства, промышленности, медицине и разработках новых биодобавок, биопрепаратов, что является гарантом.

Список литературы:

1. Сидякина Т.М. Консервация микроорганизмов в коллекциях культур // Консервация генетических ресурсов. Методы. Проблемы. Перспективы. АН СССР, Пущинский научн. центр. Институт биологической физики. Пущино, 1991.− С. 81-159.
2. Сидякина Т.М. Методы консервации микроорганизмов // Консервация генетических ресурсов.− Пущино: ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1988.− 59 с.
3. Цуцаева А.А., Ананьина А.Е., Балыбердина Л.М., Степаншк Л.В., Павленко Н.В. Опыт долгосрочного хранения промышленных штаммов микроорганизмов // Микробиология. − 2008. − Т.77. − № 5. − С. 696-700.
4. Кривушин А.А., Бобырева Т.В., Яковенко Т.В., Николаев Е.В. Методы хранения микроорганизмов-деструкторов в коллекции ФГУП "ВИАМ" (обзор) // Авиационные материалы и технологии. − №3 (56) . − 2019. − С. 89-94 DOI: 10.18577/2071-9140-2019-0-3-89-94
5. Похиленко В.Д., Баранов А.М., Детушев К.В. Методы длительного хранения коллекционных микроорганизмов и тенденции развития // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. − 2009. − №4 (12) . − С. 99–121.
6. Озерская С.М. Грибы в коллекциях культур: фундаментальные и прикладные аспекты: автореф. дис. докт. биол. наук. − М.: МГУ им. М.В. Ломоносова, 2012. −50 с.
7. Важинская И.С., Купцов В.Н., Коломиец Э.И. и др. Криоконсервация как эффективный способ хранения фитопатогенных грибов // Известия Национальной академии наук Беларуси. Биол. науки. − 2011. −№4. − С. 57–62.
8. Иванушкина Н. Е., Кочкина Г. А., Еремина С. С., Озерская С. М. Опыт использования   современных методов длительного хранения грибов во Всероссийской коллекции микроорганизмов // Микология и фитопатология. 2010. – Т. 44. − № 1. − С.19-30.
9. Куплетская М.Б., Аркадьева З.А..Методы длительного хранения коллекции микроорганизмов кафедры микробиологии МГУ // Микробиология. − 1997. – Т. 66. − № 2. − С. 283-288.
10. Куплетская М.Б., Нетрусов А.И. Жизнеспособность лиофилизированных микроорганизмов после 50 лет хранения // Микробиология 2011. Т. 80. № 6. С. 842.
11. Егоров Н.С. Руководство к практическим занятиям по микробиологии // М.: Изд-во. МГУ, 1995. – 205с.