ПИГМЕНТООБРАЗУЮЩИЕ ШТАММЫ АКТИНОМИЦЕТОВ, ОБИТАЕМЫЕ В РАЗЛИЧНЫХ АНТРОПОГЕННЫХ ЗОНАХ Г. ТАШКЕНТА

АННОТАЦИЯ

Проведено определение количественного и качественного состава актиномицетов почв г. Ташкента в различные сезоны года. Выделены чистые культуры местных штаммов актиномицетов и показана их способность к пигментообразованию. Изучены морфологические свойства выделенных в чистую культуру 35 пигментообразующих штаммов актиномицетов, которые были отнесены к роду Streptomyces.

ABSTRACT

The determination of the quantitative and qualitative composition of actinomycetes of soils in Tashkent in different seasons of the year was carried out. Pure cultures of local strains of actinomycetes were isolated and their ability to pigment formation was shown. The morphological properties of 35 pigment-forming strains of actinomycetes isolated in pure culture, which were assigned to the genus Streptomyces, were studied.

Ключевые слова: актиномицеты, пигменты, морфологические признаки, Streptomyces, окраска воздушного и субстратного мицелия, растворимый пигмент.

Keywords: actinomycetes, pigments, morphological features, Streptomyces, coloration of aerial and substrate mycelium, soluble pigment.

Введение

Актиномицеты широко распространены в почве, воде и других средах природной экосистемы. Численность и тип актиномицетов в окружающей среде определяются многочисленными физическими, химическими и биологическими факторами. Большое влияние на их состав в почвах оказывает также наличие различных стрессовых факторов, к которым можно отнести антропогенное преобразование почв. В загрязненных почвах обычно обитает большое количество актиномицетов, способных к образованию различных пигментов.

Микробные пигменты, в отличие от органических пигментов, относят к экологически безопасным и биодеградабельным соединениям, в связи с чем получение различных пигментов с помощью высокоактивных штаммов продуцентов микроорганизмов является серьезной альтернативой химическому синтезу [3; 15; 14].

На сегодняшний день актиномицеты являются выгодным источником получения пигментов в промышленном масштабе, что обуславливает все возрастающий интерес к исследованию пигментобразующей способности микроорганизмов, не требующих затрат, таких как посевные площади и длительность выращивания. Помимо этого, микроорганизмы отличаются несравненно более высокой устойчивостью и чрезвычайным разнообразием синтезируемых пигментов [4; 13].

Как известно, многие актиномицеты продуцируют пигменты самых разнообразных оттенков и цветов. Многие стрептомицеты образуют каротиноидные пигменты, черно-коричневые меланины и сине-фиолетовые антоцианы. Разнообразные пигменты определяют цвет субстратного и воздушного мицелия. Повсеместное распространение актиномицетов рода Streptomyces связано с наличием у них активных ферментных систем, позволяющих разрушать и использовать разнообразные соединения. Так, у актиномицетов выявлена способность продуцировать такие гидролитические ферменты, как амилазы, протеазы, кератиназы и т.д. [12; 11; 16].

Актиномицеты рода Streptomyces являются важными продуцентами вторичных метаболитов – антибиотиков, пигментов, токсинов, которые используются в промышленности, медицине и т.д. [5]. На способность образовывать пигменты влияет большое число факторов, в том числе и условия хранения. Так, некоторыми авторами проведены исследования по изучению пигментообразования штаммами Streptomyces lucensis ВКПМ Ac-1743 и Streptomyces violaceus ВКПМ Ac-1734, хранившимися при температуре –12 °C и –18 °C в 15%-ном растворе глицерина и в 0,9 %-ном водном растворе хлорида натрия с последующим культивированием культур на гидролизатах крахмала, и показано, что штаммы Streptomyces lucensis и Streptomyces violaceus в исходных концентрациях клеток 107 и 108 КОЕ/см³ сохранили высокий уровень жизнеспособности в течение четырех месяцев хранения в 15%-ном растворе глицерина и в 0,9%-ном растворе натрия хлорида при температурах –12 °С и –18 °С. Наибольшее количество выживших клеток получено при хранении в 15%-ном растворе глицерина при температуре –18 °С. Установлено, что штаммы Streptomyces lucensis и Streptomyces violaceus, хранившиеся в 15%-ном растворе глицерина при низких температурах, имеют более высокий уровень ингибиторной активности в культуральной жидкости, чем при хранении в 0,9%-ном растворе натрия хлорида. Показатель ингибиторной активности был выше у культур, хранившихся в 15%-ном растворе глицерина при температуре –18 °С, и находился на уровне 2600 ± 200 ИЕ/см3. Показано, что низкотемпературное хранение Streptomyces не оказывает отрицательного воздействия на жизнеспособность и биосинтетическую активность культур [7; 8; 10].

Стрептомицеты образуют различные пигменты, являющиеся продуктами вторичного метаболизма, служащими важной биохимической характеристикой актиномицетов, позволяющей говорить об известной общности их метаболизма. Они обуславливают окраску воздушного и субстратного мицелия, а также субстрата. Пигменты стрептомицетов принадлежат к различным классам химических соединений. Для практических целей их обычно классифицируют по цвету и разделяют на красно-оранжевые (продигиозин), фиолетовые (антрациклин, гризеородин, митомицин и микородин), синие (целикомицин, литмоцидин), зеленые (ферровердин и виридомицин) и т.д. [5; 9].

Исходя из вышеизложенного, целью нашего исследования являлось выявление и определение количества пигментообразующих актиномицетов в различных антропогенных зонах г. Ташкента в зимнее и весеннее время. А также изучение морфологических свойств вновь выделенных пигментообразующих штаммов актиномицетов и определение их родовой принадлежности.

Объекты и методы исследований

Объектами исследования служили 12 местных пигментообразующих штаммов актиномицетов, выделенных в чистую культуру из различных антропогенных зон г. Ташкента в зимнее и осеннее время.

Для выделения чистых культур актиномицетов использовали традиционные методы посева на плотную питательную среду крахмало-аммиачного агара (КАА), (г/л: NaNO₃ – 1,0; MgSО₄ – 1,0; K₂HPO₄ – 1,0; CaCO₃ – 3,0, NaCl – 1,0, крахмал – 10,0; вода водопроводная – 1; рН = 6,8–7,0, агар – 20,0) [2]. Определение количества микроорганизмов в 1 г исходного субстрата проводили методом серийных разведений с высевом на твердые среды [6].

С целью идентификации актиномицетов изучены их морфологические свойства, которые позволили установить систематическое положение изученных микроорганизмов. Для изучения морфологического строения культуры актиномицетов выращивали в чашках Петри на КАА, на овсяном агаре (овсяная мука – 20 г, вода – 1 л, рН = 7,4, агар-агар – 20 г) и на голодном агаре (агар – 20 г, вода – 1 л), наиболее благоприятных для спороношения. Тип цепочек спор определяли у зрелых культур на 7-й день роста. Для этого кусочек агара с мицелием помещали на предметное стекло, срезав бритвой весь лишний агар, просматривали в световом микроскопе Olympus BX-41 (Япония) при увеличении в 320–400 раз. Родовую принадлежность культур актиномицетов устанавливали по определителю актиномицетов [1].

Результаты исследования

Из почвенных образцов, отобранных из различных зон г. Ташкента (табл. 1), в чистую культуру было выделено 35 штаммов пигментообразующих форм актиномицетов.

Таблица 1.

Характеристика мест отбора проб

Проведены исследования по количественному учету актиномицетов. КОЕ (колониеобразующие единицы) – это показатель количества жизнеспособных микроорганизмов в единице объема (1 см³), в жидкости (1 мл) или в твердом/сухом материале (1 г).

Показано, что исследуемые образцы почв являются благоприятными условиями для роста и пигментообразования актиномицетов. При этом количество клеток достигало до 1,5×10³–4,3×10³ КОЕ/г почвы.

Из почвенных образцов, привезенных из различных мест г. Ташкента, по общепринятой методике в чистую культуру были выделены всего 35 пигментообразующих актиномицетов. Отдельно оценивались штаммы, образующие различные пигменты. В таблицах 2 и 3 приведены данные по количественному учету пигментообразующих культур актиномицетов, выросших на питательной среде КАА в течение 5 суток.

Таблица 2.

Актиномицеты, выделенные в зимний период (КОЕ/г)

В зимнее время обнаружены колонии актиномицетов с различными оттенками воздушного мицелия (ВМ). Всего в чистую культуру выделены 13 штаммов актиномицетов (рис. 1). Из них 2 штамма образует ВМ розовато-фиолетового, 4 – оранжевого, 3 – бледно-серого, 3 – кремового и 1 – каштанового цвета.

Таблица 3.

Актиномицеты, выделенные в весенний период (КОЕ/г)

Рисунок 1. Пигментообразующие штаммы актиномицетов (зимний период)

Весеннее время является благоприятным для размножения актиномицетов. В этот период всего выделено в чистую культуру 22 штамма пигментообразующих актиномицетов с различными оттенками ВМ: 2 штамма – розового цвета, 6 – коричневого, 3 – кремового, 1 – оранжевого, 1 – голубого, 1 – темно-зеленого, 1 – фиолетового, 3 – белого и 4 – серого цвета. Некоторые из них представлены на рис. 2.

Рисунок 2. Пигментообразующие штаммы актиномицетов (весенний период)

Для создания удобной схемы идентификации культур актиномицеты разделены на 6 секций, основываясь на окраске спороносящего воздушного мицелия (ВМ) на синтетических средах [11]. Секции в дальнейшем подразделены на ряд серий в соответствии с цветом субстратного мицелия на этих же средах.

Всего было выделено 35 штаммов пигментообразующих культур актиномицетов. Они были разделены на секции следующим образом:

ВМ голубоватый, зелено-голубоватый – секция Azureus – 2 штамма;

ВМ серый с различными оттенками – секция Cinereus – 7 штаммов;

ВМ розовый с различными оттенками, кирпичный или фиолетовый – секция Rozeus – 6 штаммов;

ВМ кремовый – секция Helvolo-Flavus – 6 штаммов;

ВМ белый с различными оттенками – секция Albus – 3 штамма;

ВМ оранжевый – секция Aurantiacus – 5 штаммов;

ВМ каштановый – секция Spadiceus – 1 штамм.

Далее нами проведены исследования по определению родовой принадлежности выделенных актиномицетов. Для этого детально изучались их морфологические свойства. Строение спороносцев является существенным признаком, который используется при определении рода культур актиномицетов [13]. При изучении морфологических свойств изученных 35 штаммов актиномицетов показано, что 8 штаммов образуют прямые спороносцы, 10 штаммов – спороносцы в виде крючков, петель, 17 штаммов – спиральные спороносцы. По совокупности изученных морфологических свойств все выделенные пигментообразующие штаммы актиномицетов были отнесены к роду Streptomyces.

Таким образом, исследование образования пигментных соединений в местных штаммах микроорганизмов позволит выявить фундаментальную роль пигментов в метаболизме местной микрофлоры, установить разнообразие синтезируемых ими пигментов и оценить биотехнологический потенциал местной микрофлоры как альтернативного источника красителей. Полученные штаммы перспективны для получения пигментов в качестве натуральных красителей, которые являются потенциально хорошей альтернативой синтетическим пигментам.

Список литературы:

1. Гаузе Г.Ф., Преображенская Т.Ф. Определитель актиномицетов. – М. : Наука, 1983. – 244 с.
2. Егоров Н.С. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. – М. : Изд. МГУ, 1995. – 205с.
3. Звягинцев Д.Г., Зенова Г.М. Экология актиномицетов. – М., 2001. – 257 с.
4. Калакуцкий Л.В., Шарая Л.С. Актиномицеты и высшие растения // Успехи микробиологии. – 1990. – № 25. – С. 26–65.
5. Лысак В.В. Микробиология : учеб. пособие. – Минск : БГУ, 2007. – 426 с.
6. Нетрусов А.Н. Практикум по микробиологии. – М. : Академия, 2005. – 600 c.
7. Принцева А.А., Шарова Н.Ю., Выборнова Т.В. Влияние низкой температуры хранения на пигментообразование штаммов актиномицетов Streptomyces lucensis и Streptomyces violaceus // Евразийское научное объединение. – 2018. – № 46. – С. 160–162.
8. Хранение культур актинобактерий – представителей родов Streptomyces и Nonomuraea методом низкотемпературной консервации / О.Н. Синева, Н.Г. Куликова, С.Н. Филиппова, Л.П. Терехова // Антибиотики и химиотерапия. – 2014. – № 59. – С. 11–16.
9. Штамм актиномицета Streptomyces lucensis – продуцент ингибитора гликозидаз // Патент РФ. № 2355755. 20.05.2009 / Шарова Н.Ю., Позднякова Т.А., Ходкевич О.А.
10. Штамм актиномицета Streptomyces violaceus – продуцент ингибитора гликозидаз // Патент РФ. № 2346042. 10.02.2009 / Шарова Н.Ю., Никифорова Т.А., Позднякова Т.А.
11. A solation of yellowish antibiotic pigment 4-hydroxy Nitrobenzene from a strain of Streptomyces / Z.S. Sathi, N. Sugimoto, M.I. Khali, M. Gafur // Pak. J. Biol. Sci. – 2002. – I. 52. – P. 201–203.
12. Anti-bacterial activity of pigments isolated from pigment-forming soil bacteria / M.D. Mamunur Rashid, M.D. Fakruddin, M.M. Reaz, K. Fatema [et al.] // Br. J. Pharm. Res. – 2014. – № 4. – P. 880–894.
13. Isolation and phenotypic characterization of actinomycetes from Rabat neighborhood soil and their potential to produce bioactive compounds / Ayoubi Hasnaa, Mouslim Assia, Moujabbir Sara, Amine Soukaina [et al.] // African Journal of Microbiology Research. – 2018. – Р. 186–191.
14. Li C., Ji C., Tang B. Purification, characterisation and biological activity of melanin from Streptomyces sp. FEMS Microbiol Lett 365 / [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://doi.org/10.1093/femsle/fny077.
15. Screening of yellow pigment producing bacterial isolates from various eco-climatic areas and analysis of the carotenoid produced by the isolate / A.P. Indra, S. Umamaheswari, S.G. Ranandkumar, C. Karthik [et al.] // J. Food Process. Technol. – 2014. – № 5. – P. 292.
16. Selvameenal L., Radhakrishnan M., Balagurunathan R. Antibiotic pigment from desert soil actinomycetes; biological activity, purification and chemical screening // Ind. J. Pharma. Sci. – 2009. – № 71. – P. 499–504.