ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ХЛОРИДНЫХ КАНАЛОВ В ПАРИЕТАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ ЖЕЛУДКА КРЫС

АННОТАЦИЯ

Проведен анализ олигонуклеотидных микрочипов высокоочищенных париетальных и энтерохромаффин-подобных клеток желудка крыс. Поиск и анализ маркерных генов эпителиальных клеток желудка подтвердил точность полученных результатов. Из 41 000 транскриптов мы обнаружили 84 гена липолитических ферментов, которые экспрессируются в желудочном эпителии.

Нами обнаружено, что мРНК 4 генов хлоридных каналов были значительно обогащены в очищенных париетальных клетках. Специфичность хлоридного канала CLIC6 для париетальных клеток была подтверждена анализом ПЦР в реальном времени и иммуноокрашиванием желез желудка.

ABSTRACT

It was conducted the oligonucleotide microarray analyses of the highly purified parietal and enterochromaffin-like cells from rat stomach. Search and analysis of marker genes for the stomach epithelial cells was confirmed of the accuracy of the results. Of 41,000 transcripts we found 84 genes for lipolytic enzymes that are expressed in the gastric epithelia.

We found that mRNAs of 4 genes of chloride channels were greatly enriched in purified parietal cells. Specificity of CLIC6 chloride channel for parietal cells was confirmed by Real-time PCR analysis and immunostaining of stomach glands. 

Ключевые слова: париетальные клетки, транскриптом, олигонуклеотидный микрочип, хлоридные каналы.

Keywords: parietal cells, transcriptome, oligonucleotide microarray, chloride channels.

Введение

Протонный насос (H +, K +-АТФазы), вероятно, будет наиболее надежной терапевтической областью в регуляции подавления кислоты. Процесс активации секреции кислоты требует изменения расположения Н+,К+-АТФазы из цитоплазматических канальцев в микроворсинки секреторного канала париетальной клетки.

Хлоридные каналы являются анионными каналами и выполняют различные физиологические функции. В частности, регуляция объема клеток, ионный гомеостаз и трансэпителиальный транспорт ионов входят в число их наиболее важных функций.  Транспорт ионов хлора через плазматическую мембрану играет важную роль в регуляции возбудимости мышц и нейронов. Во время подкисления внутриклеточных компартментов, например, эндосом, транспорт Cl- в них по соответствующим каналам нейтрализует положительный заряд протонов, переносимых Н+-АТФазами.

Кроме того, транспорт ионов хлора играет важную роль в секреции соляной кислоты в желудке. Было высказано предположение, что в этом процессе участвуют внутриклеточные хлоридные каналы (CLIC) и котранспортеры хлорида.

Целью данной работы было изучение транскриптов хлоридных каналов очищенных париетальных клеток желудка крысы с использованием метода анализа олигонуклеотидных микрочипов. В качестве контроля использовали транскриптом очищенных энтерохромаффиноподобных клеток желудка крысы.

Материалы и методы

Высокоочищенные париетальные и ECL-клетки из желудков крыс были получены центрифугированием и сортировкой клеток на основе флуоресценции. В случае париетальных клеток сортировку проводили с использованием автофлуоресценции самих клеток в присутствии 10 мм раствора глюкозы. Перед сортировкой клеток ECL в суспензию клеток добавляли 100 нмол акридинового оранжевого красителя. Чистоту выделенных клеток оценивали с помощью конфокальной микроскопии и иммуноокрашивания с использованием антител против альфа-субъединицы NK-АТФазы и гистидинкарбоксилазы.

Общую РНК из эпителия желудка (St) и высокоочищенных клеток выделяли с использованием набора NucleoSpin RNA II (BD Bioscicences). Чистоту и стабильность РНК определяли в биоанализаторе 2100 (Agilent Technologies).

Анализ олигонуклеотидных микрочипов проводили в лаборатории G. Sachs (UCLA) в соответствии с протоколом Agilent Technologies с тремя повторениями.

Количественный ПЦР-анализ в реальном времени проводили с использованием набора qPCR Dynamo SYBR Green (Finnzymes). Метод олигонуклеотидных микрочипов позволил нам получить подробный профиль экспрессии генов для определенных типов клеток слизистой оболочки желудка крысы.

Результаты и обсуждение

Ранее совместно с учеными Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе был проведен анализ олигонуклеотидных микрочипов экспрессии генов высокоочищенных париетальных и энтерохромаффиноподобных клеток желудка крысы (рис. 1). Этот метод анализа получил название "метод вычитающая гибридизация" и позволил идентифицировать некоторые специфические гены для калиевых каналов в париетальных и энтерохромаффиноподобных клеток желудка.

Рисунок 1. Анализ 44K олигонук-леотидных микрочипов 99% ПК по сравнению с общим количеством клеток желудка

Стрелкой указана место транскрипта для CLIC6 в микрочипе

Рисунок 2. Конфокальное изображение желудочной железы кролика, окрашенное поликлональным антителом CLIC6 (красный) и FITC-фаллоидином (зеленый)

Как известно, основными классами хлоридных каналов являются: лиганд-зависимые ионные каналы (рецепторы ГАМК и глицина); регуляторы трансмембранной проводимости при муковисцидозе (CTFR); хлоридные каналы (CLC); хлоридные внутриклеточные каналы (CLIC).

Ранее, используя метод анализа олигонуклеотидных микрочипов желудка крысы, мы обнаружили, что в клетках желудка экспрессируются различные типы транспортеров и каналов хлорид-ионов, такие как CLIC, ClcnkB, Clns1a, аналогичные Clcn 4-2, Clca_predicted, Mid-родственный  хлоридный канал и другие.

Таблица 1.

Ген экспрессия 4 типов хлоридных каналов

PC – париетальная клетка, ST - желудок

Поскольку содержание париетальных клеток составляет 15-20% от популяции клеток желудка, множество хлоридных каналов в микро, вероятно, указывает на их отсутствие в париетальных клетках.

Из 17 транскриптов рецептора гамма-аминомасляной кислоты A в микрочипе Gabarap11_predicted, Gabarap, Gabrr2 и Gabrq показали самую высокую интенсивность экспрессии, а среди 10 транскриптов CFTR хлоридных каналов для Abcc5 была обнаружена самая высокая экспрессия. Из 25 транскриптов семейств каналов CLC самые высокие уровни экспрессии были обнаружены для CLcnkb и Dnclc1.

Из 6 внутриклеточных каналов CLIC самые высокие уровни экспрессии генов были обнаружены для CLIC1 и CLIC5 в различных органах крысы, таких как желудок, яичники, почки и сердце крысы. В то время как высокие уровни экспрессии генов были обнаружены в CLIC6 в желудке и очищенных париетальных клетках желудка. Полученные результаты транскриптов хлоридных каналов с использованием анализа олигонуклеотидных микрочипов были подтверждены методом qPCR. Иммуноокрашивание поликлональным антителом против CLIC6 (красный) и FITC-фаллоидина (зеленый) подтвердило присутствие CLIC6 во внутриклеточной мембране париетальных клеток (рис.2).

Сравнивая транскриптов очищенных париетальных клеток и общих эпителиальных клеток (соотношение PC/ST), были обнаружены специфические для париетальных клеток гены, такие как Gabarap1_predicted, CLCNKB, Mclc, Clcn4-2 b CLIC6.

Таблица 2.

Ген экспрессия париетальных клеток специфических хлоридных каналов

PC – париетальная клетка, ST – желудок

Таким образом, поиск и анализ транскриптов в очищенных париетальных клетках на олигонуклеотид микрочипах показали высоких и специфическую экспрессию генов в хлоридных каналах. Анализ экспрессии генов хлоридных каналов с помощью метода ПЦР в реальном времени подтвердили полученные результаты методом олигонуклеотидный микрочип анализ.  Для подтверждения роли вышеуказанных париетальные клетки специфических хлоридных каналов в регуляции секреции желудочной кислоты потребуется проведение дальнейших исследования с использованием современных методов анализа экспрессии белков и биофизические методы. 

Список литературы:

1. H. CrissHartzell. Chloride Channels: An Historical Perspective. Physiology and Pathology of Chloride Transporters and Channels in the Nervous System. From Molecules to Diseases. 2010, Pages 1, 3-15.
2. H.R.de Jonge B.C.Tilly. ION TRANSPORT. Chloride Channels. Encyclopedia of Respiratory Medicine. 2006, Pages 465-471
3. Luigi Leanza, Lucia Biasutto, Antonella Managò et.al. Intracellular ion channels and cancer Frontiers in Physiology. Membrane Physiology and Membrane Biophysics September. 2013. V 4.
4. George Sachs, Jai Moo Shin, Olga Vagin, Nils Lambrecht, Iskandar Yakubov, Keith Munson. The gastric H,K ATPase as a drug target: past, present, and future. J Clin Gastroenterol. 2007. V 41. Suppl 2):S226-S242.
5. Littler, D. R., Harrop, S. J., Goodchild, S. C., The enigma of the CLIC proteins: Ion channels, redox proteins, enzymes, scaffolding proteins? FEBS Lett. 2010. V 84, pp. 2093-2101.
6. Urushidani T, Hanzel DK, Forte JG. Characterization of an 80-kDa phosphoprotein involved in parietal cell stimulation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 1989. V 256, G1070–G1081.