Влияние госсипола на каталитические свойства кислых и нейтральных микробных протеиназ

АННОТАЦИЯ

Изучено влияние госсипола на активность и стабильность кислых и нейтральных протеиназ. Показано, что нейтральные протеиназы в присутствии госсипола сильнее подвергаются инактивации и дестабилизации чем кислые.

ABSTRACT

Influence of gossypol on activity and stability of acidic and neutral proteinases was studied. It is shown that neutral proteinases in the presence gossypol are exposed to an inactivation and destabilization than acidic more strongly.

Ключевые слова: госсипол, кислая и нейтральная протеиназа, активность,  стабильность.

Keywords: gossypol , acidic and neutral proteinase , activity, stability

Введение

В настоящее время в производстве растительных масел для усовершенствования технологических процессов большое внимание уделяется применению ферментов. Так, например, ферменты с протеолитической, целлюлолитической и амилолитической активностями используются для обработки масличных семян с целью облегчения процесса  извлечение масел [1-3].Следует отметить, что при этом определенные компоненты сырья могут отрицательно влиять на каталитические свойства ферментов. К таким компонентом при переработке хлопковых семян можно отнести госсипол. Госсипол является высокоактивным химическим соединением, содержащим две альдегидные и шесть гидроксильных групп, два бинафтильных кольца, обладает способностью к таутомерным превращениям [4, 5]. Уникальные особенности строения и химических свойств молекулы госсипола позволяют ему образовывать достаточно стабильные связи с различными белками, а также легко встраиваться в фосфолипидные цитоплазматические мембраны[6]. За счет таких взаимодействий госсипол блокирует активность ряда ферментов, участвующих в различных метаболических процессах в клетках растений, микроорганизмов и многих других видов живых существ.

Можно было бы предположить, что во время ферментации хлопковой мятки или при гидратации сырого хлопкового масла, ферменты теряют активность из-за взаимодействия с госсиполом,находящимся в реакционной среде.

Целью данной работы является изучение влияния госсипола на активность и стабильность кислых и нейтральных протеиназ.

Объекты и методы исследования

В работе использовали кислую протеиназу из гриба Aspergillusniger (ПролайвPAC 30L “ЭнзимБИОПродукт” ООО, Россия)и нейтральную протеиназу из бактерий – Bacillusamyloliquefaciens (Нейтраза, «Новозаймс», Дания).

Госсипол был предоставлен институтом биоорганической химии АН РУз.

Протеолитическую активность измеряли согласно модифицированному методу Ансона [6], используя в качестве субстрата казеин.

Влияние госсипола на активность ферментов изучали в среде, содержащей 1 мл 2%ного казеина в 0.1 М универсальном буфере (СН₃СООН-Н₃ВО₃-Н₃РО₄-NаОН)при необходимом значении рН среды (рН 2.0 для кислых протеиназ и рН 7.0 для нейтральных протеиназ), 0.5 мл раствора госсипола(в 0,1 М буфере, содержащем 10% этанола)и 0.5 мл ферментного раствора. Смесь инкубировали при 30^оС в течение 10 мин. Остальные операции проводили согласно методике [7].

Термостабильность фермента изучали в инкубационной среде, подогретой до 50^оС в 0.1 М универсальном буфере при необходимом рН среды (рН 2,0 в случае кислых протеиназ и 7,0 в случае нейтральных протеиназ). Через определенное время инкубации отбирали 0.5 мл пробы и измеряли активность ферментов.Активность фермента измеряли при 30^оС, в среде содержащей 0.027-0.030 ед/мл активности и 1% раствор казеина.

Результаты и их обсуждение

Госсипол - растительный пигмент, который содержится в семенах хлопчатника и хлопковом шроте, как в свободном, так и связанном состоянии.  В хлопковой мятке содержание госсипола составляет 0,66-1,44% [8].  

При обработке хлопковой мятки ферментами, из-за взаимодействия с госсиполом, ферментативный процесс может протекать с низкой скоростью.

Исследования, проведенные нами, показали, что госсипол существенно влияет на каталитические свойства ферментов. При этом важное значение приобретает вид используемого фермента и условия проведения процесса.

На рис. 1 приведено влияние концентрации госсипола на активность кислых и нейтральных протеиназ.

Рисунок 1. Влияние концентрации госсипола на активность кислых (1) и нейтральных (2) протеиназ

Из представленных данных видно, что кислая протеиназа в меньшей степени подвергается ингибированию в присутствии госсипола в реакционной среде (рис.1, кривая 2). Тогда как, нейтральная протеиназа больше подвергается ингибированию госсиполом (рис.1, кривая 2).  При концентрации госсипола в реакционной среде до 2,5 мг/мл нейтральная протеиназа теряет до 70% первоначальной активности.

В присутствии госсипола изменяется и термостабильность ферментов. Из данных, представленных на рисунке2 видно, что термостабильность нейтральной протеиназы снижается. Так, например, через 20 мин инкубации при 50^оС в присутствии 1 мг/мл госсипола нейтральная протеиназа теряет 50% своей первоначальной активности. За это же время в отсутствие госсипола  активность фермента снижается лишь на 8-10%. Этот эффект зависит не только от госсипола, но и от природы протеиназ. Так, в случае кислой протеиназы, при той же концентрации жирной кислоты, хотя активность незначительно снижается (2%), дестабилизирующий эффект не наблюдается (рис.2, кривые 1 и 2).

Рисунок 2. Влияние госсипола на стабильность кислых (а) и нейтральных (б) протеиназ. 1 - без госсипола, 2 - в присутствии госсипола

Дестабилизирующий эффект госсипола в нейтральных средах можно объяснить образованием ковалентных связей на Шиффовы основания между аминогруппами белка и альдегидными группами госсипола. Обычно эта реакция протекает при щелочных значениях рН среды.При этом также могут образовываться дополнительные связи электростатического характера (за счет ионизированной ОН-группы), гидрофобной природы (за счет нафталинового кольца и изопропильных групп) и донорно-акцепторного типа (за счёт π-электроно-сопряжённых связей) [4].В кислой среде из-за нестойкости основания Шиффа,ковалентная связь между ферментом и госсиполом не образуется. И поэтому в случае кислых протеиназ не наблюдается снижения активности и термостабильности в присутствии госсипола.

Госсипол также влияет на кинетические константы ферментативных реакций. На рисунке 3 приведена зависимость скорости гидролиза субстрата от его концентрации в присутствии госсипола в координатах Лайнуивера-Берка. Видно, что величина максимально достигаемой скорости реакции не изменяется в присутствии госсипола (отрезок на оси ординат).

Рисунок 3. Влияние концентрации субстрата на активность нейтральных протеиназ в отсутствие (1) и в присутствии госсипола (2) в координатах Лайнуивера-Берка

Вместе с тем, эффективное значение кажущейся константы Михаэлиса растёт (отрезок на оси абсцисс). Это позволяет предположить, что госсипол не только делает фермент более чувствительным к тепловой денатурации, но и, в определённой степени, снижает сродство нейтральной протеиназы к своему субстрату, а следовательно, ухудшается способность фермента осуществлять каталитическую стадию процесса гидролиза.

Заключение

Таким образом, при переработке полупродуктов семян хлопчатника, госсипол, содержащийся в растительном сырье может отрицательно влиять на ферментативные процессы. При этом из испытанных ферментов, кислая протеиназа из гриба Aspergillusniger является более устойчивой к госсиполу, по сравнению с нейтральной протеиназой из бактерии Bacillusamyloliquefaciens.

Список литературы:

1. Latif  S., Anwar F., Ashraf  M. Characterization of enzyme-assisted cottonseed oil by cold pressing // J Food Lipid. -2007. -V14. -№ 4. –P.424–436.
2. Хасанов А.Х., Давранов К.  Влияние ферментативной обработки хлопковой мятки на процесс извлечения масла//Химия и химическая технология, -2015. - № 2 . -С.60-63.
3. Soto C.G., Chamy R., Zuniga M. Effect of enzymatic application on Borage (Borago officinalis) oil extraction by cold pressing // J Chem Eng Japan. -2004. -V.37. -№3. -Р.326–331.
4. Kenar J. A.   Reaction Chemistry of Gossypol and Its Derivatives //JAOCS,-2006, -V. 83, -№ 4, -P.269-302.
5. Хаитбоев А.Х. Синтез производных госсипола с гетероциклическими аминами // Химия растительного сырья. -2014, -№1,  -C.105-108.
6. Strоm-HansenT., CornettC. and Jaroszewski J.W. Interaction of gossypol with amino acids and peptides as a model of enzyme inhibition// International Journal of Peptide and Protein Research. -1989, -V.34,  -Issue 4,  -P.306–310.
7. Препараты ферментные. Метод определения протеолитической активности. М., 1985, ГОСТ 20264.2-85.
8. Руководство по технологии получения и переработки растительных масел и жиров/Под. редакцией А.Г. Сергеева, -Л.: ВНИИЖ. -1974. -Том1, -580 с.