Изучение процесса получения пиноцембрина – стандарта

Введение. Как ранее сообщали в Институте химии растительных веществ им. академика С.Ю. Юнусова АН РУз из надземной части солодки голой (Glycyrrhiza glabra L., сем. Fabaceae – бобовых) была выделена сумма флавоноидов, основными из которых являются пиноцембрин, глабранин, пурнетин [1]. Исследования показали, что мажорным флавоноидом в надземной части солодки является пиноцембрин, содержание которого достигает до 0,9% [2].

На основе суммы флавоноидов из надземной части солодки голой создано лекарственное средство «Глацембрин», обладающее противовоспали­тельным и обезболивающим действием [3].

Субстанция глацембрин представляет собой порошок от зеленовато-желтого до зеленовато-коричневого цвета со специфическим запахом, очень мало растворимый в 96% спирте, практически нерастворимый в хлороформе и воде. Стандар­тизацию субстанции проводят спектрофотометрическим методом в пересчете на пиноцембрин стандарт.

Целью исследования. С целью получения пиноцембрина надземную часть солодки голой экстрагировали хлороформом. Хлороформные фракции сгущали до сухого остатка.

В хлороформном экстракте помимо флавоноидов содержатся сопутствующие вещества, представляющие собой органические кислоты, хлорофиллы и другие примеси. Поэтому для выделения пиноцемрина из суммы флавоноидов целесообразно использовать хроматографический метод разделения на силикагеле.

Полученные научные результаты и их обсуждение

Надземную часть солодки ( 7,0 кг) экстрагировали 4 раза хлороформом, настаивая по 6-8 ч. Гидромодуль процесса 1:15. Объединенный хлороформный экстракт упаривают в вакуум-циркуляционном аппарате. Выход хлороформного извлечения 504,0 г.

Хлороформное извлечение хроматографировали на колонке (6х120 см) с силикагелем ( 4 кг) марки КСК с размерами частиц 0,1- 0,25 мм. Для очистки от липофильных и смолистых веществ колонку последовательно промывали смесью растворителей:

• хлороформ – бензин в соотношении 1:1, r=1.095;
• хлороформ - бензин 3:1, r=1.290;

Опыты проводили следующим образом: в колонку с силикагелем наносили сгущенный хлороформный экстракт. Фракции элюата по 500 мл проверяли качественно методом тонкослойной хроматографии на пластинках «Silufol» в системе растворителей хлороформ - бензол - метанол (19:1:1). Проявитель - пары аммиака.

Сопутствующие вещества с колонки смывали 8 л смеси бензин - хлороформ 1:1, (элюат удаляют из технологического цикла). Далее колонку промывали системой бензин - хлороформ 1:3, при этом получили технический пиноцембрин ( 30,0 г). Затем технический пиноцембрин кристаллизовали из смеси растворителей хлороформ – гексан 3:2 и выделили пиноцембрин - стандарт ( 25,0 г). Кристаллы отделяли и сушили в сушильном шкафу при 70°С. Выход пиноцембрина составил 0,35% к массе сырья. Фракции, содержащие пиноцембрин, объединяли и сушили в вакууме. Чистота продукта составила 96,0%.

Влияние условий экстракции на выход продукта иллюстрируется в таблице 1. 

Таблица 1.

Влияние гидромодуля процесса экстракции сырья и соотношения смеси растворителей хлороформ – бензин на выход пиноцембрина

Из данных таблицы 1 видно, что максимальный выход экстрактивных веществ получен при соотношении сырья к растворителю 1:15. Оптимальное соотношение смеси растворителей хлороформ - бензин при элюации пиноцембрина из колонки - 3:1.

Далее найдено оптимальное соотношение смеси растворителей для удаления сопутствующих веществ из суммы экстрактивных веществ. Для этого по 100г сгущенного хлороформного экстракта загружали в колонку с 800 г силикагеля, и сопутствующие вещества элюировали органическими растворителями и их смесями. Элюат упаривали досуха и взвешивали. При этом максимальное извлечение сопутствующих веществ достигается при промывании колонки смесью растворителей хлороформ-бензин1:1.

Используя литературные данные и получив априорную информацию, влияющую на процесс, далее оптимизировали условия разделения пиноцембрина из суммы флавоноидов с помощью плана типа латинский квадрат 3х3 [4].

Для чего исследовали влияние на процесс следующих факторов:

А - соотношение высоты сорбционного слоя к диаметру колонки на уровнях: А₁ =6:1; А₂=4:1; А₃=2:1;

В - скорость элюирования: В₁=20 л/час м²; В₂=40л/час м²; В₃= 60 л/час м²;

С - соотношение суммы, наносимой в колонку, и сорбента: С₁=1:2,5; С₂=1:5 С₃=1:7,5.

Каждый опыт проводили следующим образом: сгущенный хлороформный экстракт, полученный из 0,1 кг надземной части солодки голой, хроматографировали в колонке с силикагелем смесью растворителей хлороформ-бензин 1:1. Хроматографическое разделение пиноцембрина проводили под влиянием параметров, приведенных в табл. 2. Фракции элюата, содержащие пиноцембрин, объединяли, сгущали, сушили при температуре 50-60 ºС и вакууме 0,6-0,8 кгс/см². Далее определяли выход технического пиноцембрина от массы сырья.

Проведено 9 опытов, повторяя дважды, и брали средний результат из двух значений (N=9, f=2). Результаты опытов приведены в табл. 2.

Таблица 2.

План и результаты эксперимента

Результаты суммы показателей каждого фактора T_ij, а также исходные данные для дисперсионного анализа представлены в таблице 3.

Таблица 3.

Результаты эксперимента (среднее из двух значений)

Показатели факторов рассчитали по формуле:

T = ST_ij = 4,1

Для установления значимости влияния факторов провели дисперсионный анализ результатов эксперимента. Результаты расчета представлены в таблице 4.

Таблица 4.

Дисперсионный анализ латинского квадрата

Табличное значение критерия Фишера F_{табл.(2,9)}=4,3.

Таким образом, значимы факторы А, В и С, так как значения F_А, F_В, F_С больше чем F_табл.

Наибольший выход пиноцембрина 0,93% получен при условиях А₂В₂С₂, т.е. соотношение высоты сорбционного слоя к диаметру колонки на уровнях - 4:1, скорость элюирования - 40л/час м², соотношение суммы, наносимой в колонку -1:5.

С целью получения стандартного образца пиноцембрина, соответствующего требованиям НТД, был разработан способ очистки технического пиноцембрина методом кристаллизации.

Для этого были проведены эксперименты по выявлению необходимого времени для полной кристаллизации пиноцембрина. По 3 г технического пиноцембрина растворяли при нагревании на водяной бане в смеси растворителей хлороформ-гексан 1:1 до полного растворения, одновременно добавляли активированный уголь в количестве по
0,2 г. Полученные растворы фильтровали, сгущали до половины от первоначального объема и оставляли в кристаллизаторах на: 4 ч, 8 ч, 12 ч, 24 ч.

Выпавший во всех случаях осадок отделяли, сушили и анализировали, при этом для полной кристаллизации пиноцембрина необходимо не менее 8 часов.

По результатам исследований определены условия процесса кристаллизации, заключающиеся в следующем: кристаллизацию технического пиноцембрина следует проводить из смеси хлороформ-гексан 1:1 с одновременным добавлением активированного угля, сгущая раствор пиноцембрина до половины от первоначального объема, с последующим выдерживанием в кристаллизаторе не менее 8 часов.

Пиноцембрин представляет собой мелкокрис­таллический порошок серого цвета, растворимый в 95%-ном спирте, умеренно растворимый в хлороформе, практически нерастворимый в воде, очень мало и медленно растворимый в метиловом спирте.

Чистоту пиноцембрина контролировали по величине удельного показателя поглощения в метиловом спирте (Е^1%_1см=446±5), что согласуется с данными литературы.

Состав пиноцембрин-стандарта: С₁₅Н₁₂О₄, т.пл, 194-196 ⁰С.

УФ-спектр (МеОН, l_мах, нм) 292, 324 (рис. 1).

В ИК-спектре (KBr, v, см^-1) (ОН) 3439, (СН₃) 2924, (С=O) 1632 (С=C) 1604, 1487, (С-O) 1168, 1086, 1060 (рис. 2.). 

Рисунок 1. УФ-спектр пиноцембрина

Рисунок 2. ИК-спектр пиноцембрина

Полученный нами пиноцембрин используют для определения содержания флавоноидов в субстанции глацембрина в качестве стандарта.

Выводы: 1. Таким образом, на основании полученных данных, провели процесс разделения суммы флавоноидов хлороформного экстракта из надземной части Glycyrrhiza glabra с целью выделения пиноцембрина.

2. Перекристаллизацией технического пиноцембрина из смеси растворителей хлороформ-гексан 1:1 выделили пиноцембрин–стандарт, выход которого составил 0,35% от массы сырья.