Исследование способа получения биоэтанола из нетрадиционного сырья

На протяжении столетий люди эксплуатировали сырьевые ресурсы Земли. Последние десятилетие многие страны столкнулись с реальным дефицитом нефти, природного газа. Проблема ограничения ископаемых видов топлива и стремление многих стран уменьшить свою зависимость от поставок импортной нефти стимулировали возрастающий в мире интерес к возобновляемому и практически неисчерпаемому источнику энергии, перспективному сырью, продукту фотосинтеза. Целлюлоза является основным по массе органическим веществом биосферы. Вместе с тем целлюлоза растений не полностью используется животными, всего на 20-25%, без специальной дополнительной предобработки [1-3].

Основная проблема, связанная с утилизации целлюлозы состоит в том, что в отличии от крахмала она не является природным полисахаридом, который по мере потребности может превращаться в глюкозу. Напротив целлюлоза устойчивый к различным воздействиям структурный компонент растений. Устойчивость его обеспечивается другими структурными компонентами-лигнином, который занимает второе место по количеству после целлюлозы. Поэтому одна из основных задач современной биотехнологии научиться использовать это трудно метоболизируемое, но широко распространенное в природе органическое соединение и использовать его более эффективно, чем сжигание и загрязнение биосферы. Для решения стратегических, социальных и экономических проблем сегодняшнего дня представляется целесообразным переработка растительного сырья: - отходы сельского хозяйства - солома, листья, стебли различных растений, кукурузные кочерыжки, подсолнечная лузга, отходы хлопководства, отходы бумажных производств, отходы пищевой промышленности в разнообразные продукты, необходимые народному хозяйству [4-7].

Утилизация отходов сельского хозяйства и пищевой промышленности с целью получения полноценных кормов, кормовых дрожжей, биоэтанола, фурфурола, органических кислот и глюкозы по экологически чистой энерго и теплосберегающей биотехнологии должна развиваться по программе целевых проектов по модернизации и техническому обновлению отраслей биотехнологии, внедрению инновационных технологий. Производство этанола и метана, образующиеся из растительной биомассы наиболее эффективным способом биоконверсии, имеют стратегическое значение, как энергетические источники, доступные человечеству уже сегодня [8].

Ряд авторов считают, что технологические процессы получения различных видов жидкого топлива, включая этанол из продуктов гидролиза целлюлозы и гемицеллюлозы наиболее перспективны, так как ферментация углеродного сырья не требует применения сложного оборудования, больших капитальных и энергетических затрат, субстратами могут служит отходы целлюлозно-бумажной, пищевой промышленности, зерновые и целлюлоза содержащие отходы сельского хозяйства.

Ежегодно масложировых комбинатах из кожуры семян получают 500-600 тыс.т. хлопковой шелухи, побочного продукта производства масла. Шелуха бывает двух видов: шелуха, полученная из семян имеющих подпушок на поверхности и из оголенных семян - называемой- лузгой. Листья хлопчатника по химическому составу являются превосходным сырьем для производство кормов для птицеводства.

На 1га приходится 2,5-3т листьев после чеканки, листья являются источником органических кислот (лимонной, яблочной) до 6-8% к весу сухих веществ. Листья хлопчатника также богаты незаменимыми аминокислотами, и витаминами, каратином (провитамином А), инозитом, рибофлавином.

Листья хлопчатника отличаются не только наличием незаменимых аминокислот, но и высоким содержанием протеина- до 16%, в отчеканенных верхушках растения до 12-20%, в люцерне 13-14% 13-14%, в кукурузных стеблях- 3-4%. В листьях хлопчатника содержатся углеводы: сахарозы (4,5%), мальтозы (1,76%), крахмал (2,52%) и гемицеллюлозы легко гидролизуемые до (6,06%). В коробочках преобладает сахароза, которая необходима для формирования урожая хлопка- сырца. В хлопчатнике накапливается много золы, в листьях до 27%, в пшеничной соломе-8,4, кукурузных стеблях- 8,9% [9, 10]. В состав золы листьев входят такие микроэлементы как марганец, медь, молибден, серебро, стронций, титан, магний, цирконий, цинк, кобальт, повышающие их кормовые достоинства. Высокое содержание органических кислот, витаминов незаменяемых аминокислот, белковых веществ, углеводов и микроэлементов в экстрактах листьев можно использовать как стимулятор роста, растений, микроорганизмов а также биоконверсии лигноцеллюлозных субстратов. В отходах хлопчатника коробочках и стеблях - гузапоя определяли количество целлюлозы и лигнина.

Были получены два образца отходов, которые высушили, размалывали до частиц размером 1мм и определяли целлюлозу по модифицированному методу Ермакова А.И., лигнин по Вильштетеру и Цехмейстеру. [12] Полученные данные приведены в таблице-1. Исследовали 2 образца стеблей и 2 образца коробочек. Результаты приведены в таблице-1 анализ на содержание целлюлозы и лигнина проводили в трех повторностях, в таблице приведены средние данные.

Как видно из результатов анализа, в коробочках содержание целлюлозы и лигнина значительно меньше, чем в стеблях, что по видимому объясняется химическим составом коробочек, отличающиеся также структурой, что подтверждается данными литературы.[11]

Таблица 1.

Содержание целлюлозы и лигнина в отходах хлопчатника

Процесс биоконверсии лигноцеллюлезных отходов хлопчатника створки и стебли проводили базидальными микроскопическими грибами штамм 1. Культурная среда характеризовалась следующей ферментативной активностью: целлюлаза активность ед/мл=14,4; А ксиланаза – 22.4 ед/мл; А лигниниза- 18,6 ед/мл; белок- 5,6 мг/мл.

Из культуральной среды отделяли грибной мицелий от культуральной жидкости путем фильтрования. Культуральная жидкость использовалось для гидролиза лигноцеллюлозы, мицелий оставшийся после фильтрации использовали для твердофазной биоконверсии, отдельно хлопковые створки и хлопковые стебли. В колбу 1 объемом 250 мл вносили створки- 10 гр, колбу 2 стебли 10 гр. В каждую колбу добавляли по 10% воды автоклавировали в течение 1час при 160^оС и после охлаждения в каждую колбу вносили по 50мл мицелий, твердофазное культивирование проводили в течении 7 суток с периодическим перемешиванием на качалке. Опыты при глубинной ферментации проводились с целью биоконверсии лигноцеллюлозы с добавлением в среду 50мл. жидкой культуральной жидкости +50 мл. стерильной водопроводной воды. Опыт 1 проводили без добавления в среду пшеничных отрубей. Опыт 2 с добавлением в среду хлопковой шелухи 15гр + 5гр пшеничных отрубей с целью обогащение культуральной среды азотом, липидами и минеральными веществами. Глубинная ферментация проводилась в течения 12 час.

Таблица 2.

Биоконверсия лигноцеллюлозных отходов хлопчатника базидальными грибами

Исследованиями установлено, что добавление к 15гр хлопковой шелухи + 5гр пшеничных отрубей почти в 5 раз увеличило степень гидролиза, целлюлозы и составило 23,2% по сравнению с опытом 1, куда не добавляли.

Исследования показали неполноценность питательной среды разбавленной в 2 раза для культивирования базидальных грибов при использовании только хлопковой шелухи из створок и стеблей и в последующих опытах было необходимо добавлять отходы пищевой промышленности пшеничные отруби или хлопковую лузгу.

Использование твердофазного культивирования базидальных грибов имело цель предварительной обработки хлопковой шелухи (створки и стебли) С целью повышения степени их усвояемости животными. Известно, что лигноцеллюлозные отходы сельского хозяйства, в частности целлюлоза хлопковой шелухи усваивается на 25%, опыты 3,4,5,6 показали, что возможно увеличение степени гидролиза целлюлозы, если проводить предобработки хлопковой шелухи раствором 0,7-1% H₂SO₄ и кипячением, что позволяет расщепить надмолекулярный матрикс, состоящий из ковалентно связанного лигнина с гемицеллюлозой, протопектином, исследования показали, что такая предобработка хлопковых створок и стеблей позволяет в 2 раза увеличить степень биоконверсии целлюлозы до глюкозы на 22%, но это не предел, так как биоконверсия как показали опыты по глубинной ферментации базидальных грибов необходимость обогащение хлопковой шелухи азотистыми веществами другими отходами пищевой промышленности, использовать термофильные штаммы ассоциации бактерии базидомицетов или использовать способ парового или воздушного взрыва. Эти исследования нами будут продолжены. В настоящее время появились высокостабильный целлюлозный комплекс для высокоэффективного гидролиза лигноцеллюлозной биомассы, что позволит ускорить процессы биоконверсии растительной биомассы.

Биоконверсия лигноцеллюлозных отходов хлопчатка термофильными базидомицетами. Опытами по изучению термофильных штаммов базидомицетов проводили штамм 2-40⁰С и штамм 3-5⁰С. рН 48-5,2. Помимо глубинной ферментации гриба был использован способ твердофазного культивирования хлопковой шелухи из смеси коробочек и стеблей. Опыты проводились в конических колбах емк.-300 мл. Глубинную ферментацию хлопковой шелухи проводили со штаммом-2 при 40⁰С и штаммом-3 при 50⁰С, продолжительность ферментации 5 часов при постоянном перемешивании на качалках.

При твердофазном культивировании на автоклавированную шелуху вносили мицелярную культуру в количестве 5,0 гр. отделенной из культуральной жидкости: перемешивали в стерильной колбе емк.-300 мл и ферментировали при периодическом перемешивании на качалке. Степень гидролиза целлюлозы в 10% вытяжке из субстрата с культурой гриба. Вытяжки получали путем настаивания грибной культуры с водой в течение 2 часов, с последующим отделением биошрота при центирифугировании при 5000 об/мин. Ферментацию проводили в течение
7 суток. Результаты исследования представлены в таблице-3. Как видно, из данных таблицы-3, опыты проведенные с термофильными штаммами соответственно, № 2 и № 3 при оптимальной температуре, 40⁰С и 50⁰С, результаты исследования показали, что оба штамма имеют почти одинаковую степень гидролиза в течение 5 час ферментации.

Последующую глубинную ферментацию проводили штаммом № 3 с добавлением к субстрату вместо пшеничных отрубей – азотистое вещество карбамид, не только с целью повышения азота в культуральной среде, но и с целью связывания госсипола хлопковых отходов карбомидов в связанное состояние. Так как известно, что нативный госсипол даже в малых дозах, обладает высокими антимикробное воздействие на базидомицеты.

Так известно из данных литературы, что добавление в культуральную жидкость карбамида - мочевины ингибирует активность целлюлаз, что подтверждают полученные нами результаты. С повышением количества карбамида внесенного в среду уменьшалась степень гидролиза целлюлозы. Такие же результаты получены и при твердофазном культивировании.

При 7-суточном твердо фазном культивировании повышении количества карбамида до 1 грамма снизила степень гидролиза целлюлозы почти в 2 раза. Такие же результаты были получены при глубинном культивировании. Это объясняется тем, что часть карбамида которое остается после связывания нативной формы госсипола в связанную, по видимому ингибирует активность целлюлоз.

Базидиомицеты - являются хорошим продуцентом внеклеточных ферментов в пост экспоненциальную фазу роста. Дальнейшее их культивирование в условиях значительно ускорить процесс биоконверсии целлюлозы, в связи с поддержанием их в условиях «сверх синтеза» целлюлаз и др. ферментов. Базидальные грибы обладают высокой активностью одновременно целлюлаз, ксиланаз и лигниназ для максимального проявления и ускорения, и более глубокого гидролиза лигноцеллюлозы необходимо оптимизировать среду культивирования белком, так как из данных литературы известно, что активность целлюлаз чувствительно к количественному содержанию в среде белка.

 Таблица 3.

Биоконверсия лигноцеллюлозных отходов хлопчатника термофильными базидомицетами