СОЗДАНИЕ НОВОЙ ПЦР (ПОЛМЕРАЗНЫЕ ЦЕПНЫЕ РЕАКЦИИ) СИСТЕМЫ (REAL-TIME) ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ LISTERIA MONOCYTOGENES В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ И В ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЕ

АННОТАЦИЯ

В данной статье рассматривается вопрос о разработке экспресс – теста по обнаружению патогенной бактерии листерия в пищевых продуктах и в пробах из окружающей среды. Также описываются преимущества данного метода по сравнению с другими методами, имеющимися в литературе.

ABSTRACT

This article discusses the development of an express test for the detection of the pathogenic bacterium Listeria in food products and in samples from the environment. The advantages of this method in comparison with other methods available in the literature are also described.

Ключевые слова: патогенные бактерии, L.mon., детекция, ПЦР –анализ, ELISA, чувствительность, специфичность, разрешающая способность.

Keywords: pathogenic bacteria, L.mon. , detection, PCR analysis, ELISA, sensitivity, specificity, resolution.

Введение

Listeria monocytogenes является пищевым патогеном для человека, который вызывает листерию, наносящий потенциальный вред здоровью иммуноослабленных людей, пожилых, беременных женщин (группы риска). Традиционные методы обнаружения данного патогена требуют до 7 дней в случае позитивного результата. Были разработаны ПЦР методы для сокращения этого времени, он они имеют некоторые осложнения из-за множества стадий обнаружения. Эти стадии нуждаются в различных манипуляциях и могут генерировать контаминанты. Во избежании этих проблем и для сокращения времени обнаружения мы разработали ПЦР – систему, которая использует простые реагенты, канечный циклер, соединенный с камерой и чистой посудой (Био-Ряд) [1,3,5,6,11]. Эта система может обнаруживать L.mon. в пищевых продуктах (ПП) и в окружающей среде. Она состоит из 3-х стадий: культура предварительно обогащается, экстрагируются образцы ДНК и стадию амплификации ПЦР в режиме реального времени (real-time) ( в реальном времени) [2,4,7,8].

Последовательность нуклеотидов в целевом гене. Ген амплифицируется и детектируется в ходе ПЦР, используя специфические праймеры и пробы. Этот ген h/у А. Он кодирует детерминант для листериолизина О, который вовлекается в процесс вируленции и является высоко специфичным для L.mon. Этот концервированный ген патентируется.

Флуоресцентная проба. Обнаружение производится в ходе амплификации, используя специфически флуоресцирующие олигонуклеотиды, названные молекулярным образцом, который гибридизируется с амплифицированным продуктам, которые комплементарны друг другу. Флюорофоры привязываются к 5’ концу, проба прикрепляется к 3’ концу молекулы ДНК. Эта проба построена таким образом, что при отсутствии целевой последовательности, два комплементарные цепи гибридизуются друг с другам и проба не флюоресцирует, т.к. флюорофор и маркер теперь находятся близко друг к другу. Если L.mon. присутствует в образце, то ген h/у А амплифицируется и молекулярный образец гибридизуется с амплифицированным продуктом. В этом случау флюорофор и маркер отделяюся друг от друга и проба будет флюоресцировать [4,9,10,11].

Промежуточный контроль. Такой контроль проводится с каждым реакцияционным сосудом, в качестве монитора успешной амплификации ДНК в каждой реакции. Амплификация проводится в одно и то же время, что и целевой ген L.mon., но детектируется вторым флюорофером.

Анализ является специфическим, чувствительность и разрещающая способность этой системы приводится в данной статье.

Экспериментальная часть

Бактериальные штаммы были получены из лаборатории многофункционального диагностического центра. Для специфических проб они культивировались в течении 18 r при 37^оС в соответствующей питательной среде.

Предварительное обогащение: 25 г испытуемого образца инкубировалась в 225 мл культуральной среды в течении 24 ± 2 r при 30^оС.

Экстракция ДНК: 1 мл обогащенной культуры центрифугировалась 6 мин при 12000 об/мин. В тюбик добавляли 200 мл анализирующего реагента А, перемащивали, инкубировали 15 мин при 54^оС, нагревали 6 мин при 100^оС и центрифугировали 6 мин при 12000 об/мин супернатант брали для ПЦР анализа.

ПЦР анализ: в 96 луночное плато ПЦР добавляли по 5 μл образца и смещивали с 5 μл реагента. В (специальная флуоресцентная проба) и 40 мл реагента С (оптимизированная смесь для амплификации, содержащая целевую полимеразу, специальные праймеры, оHTФ, промежуточный, внутренный контроллер и буфер). Затем проводили ПЦР анализ.

Результаты и их обсуждение

Специфичность метода определяли тестированием реакции 50 штаммов L.mon. и 39 других штаммов. Результаты сведены в табл.1. Все тестированные штампы L.mon. давали положительный результат, а вес остальные штаммы показали отрицательный результат. Таким образом, эти данные показывают высокую специфичность предложенного нами теста.

Таблица 1.

Штаммы бактерий тестированных на наличие реакции ( + или -)

Чувствительность данного метода в отношении L.mon. проверялась использованием серии разбавлений частой целевой ДНК, чистую суспензию культуры L.mon. и множество образцов ПП с различными концентрациями L.mon. Результаты показывают, что данный метод имеет уровень чувствительности в 5 копий целевого гена, или может детектировать 10² L.mon. КФЕ/мл, а также от 1 до 10 КФЕ в 25 г образца различных ПП (табл.2).

Таблица 2.

Чувствительность образцов

Разрешающая способность метода

Данный метод сопоставлялся с двумя другими методами. 1-й, PROBELLA TM, который принадлежит AFNOA [2]. Он является ПЦР методoм, который проводится после стадии предварительного обогащения, подобно наш метод. В соответствии с ним амплифицированные ПЦР – продукты детектируются в 96-луночном плато после сэндвич гибридизации и колориметрического определения. 2-й метод, используемый для сравнения относительной разрещающей способности является иммуно-ферментативный типа ELISA [3]. Подобно PROBELLA и метод ELISA, наш метод способен обнаруживать 3-4 КФЕ L.mon. в 25 г сыра (табл.3).

Таблица 3.

Сравнение результатов двух методов на пробах из молока

Однако, метод ELISA предусматривает дополнительное 24 r обогащение для получения чувствительного эквивалента к методу PROBELLA. Метод ELISA также менее чувствительна по сравнению с нашим методом при обнаружении L.mon. в 50 г голубого сыра, даже после проведения дополнительного 24 r обогащения (табл.4.).

Таблица 4.

Сопоставление двух методов на образцах 24 r , 48 r

По сравнению с PROBELLA наш метод способен обнаруживать также в образце, содержащей 5 КФЕ и даже с 1-2 КФЕ L.mon. в 25 мл непастеризованного молока (табл.5). Поэтому наш метод показывает чувствительность такую же, или лучше, чем PROBELLA и ELISA при обнаружении L.mon. [5,6,7].

Таблица 5.

Сопоставление результатов анализа по двум методам на примере образцов рыбных кормов

Далее, 5 неизвестных образцов тестировались, используя наш метод или другие методы при лабораторном исследовании. Результаты совпадают с полученными в других исследовательских центрах (табл.6), использующие методы, отличающиеся от нашего.

Таблица 6.

Результаты, полученные из анализа 5 неизвестных проб в различных лабораторияx

Исследование матрикса наш метод успешно подтверждался на многих образцах ПП (табл.7).

Таблица 7.

Тестированные материксы ПП (образцы ДНК разбавлялись 1/10)

Заключение

Приведенные в статье результаты показывают высокую специфичность и чувствительность нашей системы для обнаружения L.mon. в различных образцах ПП. Детекция проводится в режиме реального времени, делая метод быстрым, чем другие ПЦР-системы. Риск контаминации значительно уменьшается, т.к. и амплификация и детекция проводятся в закрытом сосуде. Этот метод прост для применения, т.к. использует простые реагенты и приборы. Анализ проводится в 96-луночном плато, очень простой формат для анализа. Разрабатываются другие форматы для применения.

Список литературы:

1. Shindler V et. all. “Bio-Rod” PCA Program, ITBV, Marnes la Conguctte, France,  2018.
2. Cossard et al. Infeсtion and Immunity, 106, 122-128, 2018.
3. Tyagi et al. Nature Biotechnology, 44, 101-108, 2016.
4. Мухамадиев  Б.T.  «Эндогенные токсиканты пищевых продукты», Proced.Int.Con.,Germany, V.I., Issue 5, Nov. 2021.
5. Mukhamadiev B.T. “Immune-enzyme method of food safety analysis.” IOP Cons.ser. 848, 012185, pp. 1-7, 2021
6. Mukhamadiev B.T. “Implementatin ELISA method in food safety analysis”, Int.Congr. Food Science and Technobogy, Brisban, Australia, 104, 2009
7. Mukhamadiev B.T. “Chemical Risk analysis  of foods by  ELISA”, Int.ang EEFOST, Budapest, Hungary, 171, 2009
8. Рузиева К.Э., Мухамадиев Б.Т. Определение критических контрольных точек в цепи агрофув производства. UNIVERSUM: Технические науки (научные журнал) .  № 3 (96)  март  2022, Часть 4 С. 31-34
9. Бердиева З.М., Мухамадиев Б.Т. Безопасность функциональных пищевых продуктов (ФПП). UNIVERSUM Технические науки (научные журнал) .  № 2 (95)  феврал  2022, Часть 4 С. 62-66.
10. Berdieva Z.M., Mukhamadiev B.T. Process Generated Cjntaminanrs. In Volume 4 of Czech Journal of Multidisciplinary Innovations Volume 4, April. 2022 17-20 p
11. Атоев Э. Х., Гафурова Г. А. Рафинирование и экстракция семян тыквы сверхкритической углекислотой //Universum: технические науки. – 2020. – №. 5-2 (74). – С. 26-28.