АНТИМИКРОБНАЯ АКТИВНОСТЬ ПЕПТИДОВ ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ БЕЛКОВ СЕМЯН АМАРАНТА И ДРУГИХ ПРОДУКТОВ ПЕРЕРАБОТКИ АМАРАНТОВОГО ЗЕРНА

АННОТАЦИЯ

Изучена антимикробная активность пептидов, полученных путем ферментативного гидролиза альбумина, глобулина, глютелина из семян амаранта сортов Харьков нейтральными (Bacillus amyloliguefaciens) протеиназой. Показано, что на основе белков из семян амаранта можно получить пептиды с антибактериальными свойствами для Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus и Вacillus subtilis.

ABSTRACT

Antimicrobic activity of the peptides obtained from amaranths of albumine and anothers products with neutral (Bacillus amyloliquefaciens) proteinases was studied. It is shown that on the basis of proteins from amaranths possible to obtained peptides with antimicrobic properties for culture of Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus and Вacillus subtilis.

Ключевые слова: амарант, белки, гидролиз, пептиды, антимикробная активность.

Keywords: amaranth, proteins, hydrolysis, peptides, antimicrobial activity.

Введение. Растения являются богатым источником разнообразных биологически активных веществ, в том числе пептидов. Многие пептиды растений выполняют непосредственно защитные функции, обеспечивая устойчивость растений к биотическому и абиотическому стрессу. Таковыми являются антимикробные и инсектицидные пептиды, подавляющие рост и развитие патогенных грибов и бактерий [4].

Антимикробные пептиды (АМП) разнообразны по структуре и механизму действия. На основе гомологии аминокислотных последовательностей и пространственной структуры их подразделяют на несколько семейств: дефензины, тионины, липидпереносящие белки, гевеино- и ноттиноподобные пептиды, а также макроциклические пептиды [2]. Так, первыми дефензинами, для которых была показана антифунгальная активность, были пептиды семян редьки Rs-AFP1 и Rs-AFP2. При прорастании семян эти пептиды выделяются в окружающую среду, защищая проросток от заражения грибами [9].

В дальнейшем, дефензины, которые обладают антимикробной активностью, были выделены из большого числа растений [5;7;12].

Антимикробные пептиды действуют как на грамм-отрицательные, так и на грамм-положительные бактерии, а также на грибы, вирусы, простейшие. Молекулы АМП как правило положительно заряжены, что помогает им взаимодействовать с отрицательно заряженными мембранами бактерий [8]. Кроме того, АМП проявляют антимикробную активность в отношении штаммов бактерий, устойчивых к антибиотикам. Поэтому АМП могут использоваться в качестве моделей для разработки лекарственных препаратов нового поколения.

Целью данной работы является исследование антимикробной активности пептидов, полученных из белков семян.

Объекты и методы исследования. В качестве белковых субстратов использовали водорастворимые и солерастворимые белки, выделенные из зерна амаранта. В работе использовали нейтральную протеиназу из бактерий – Bacillus amyloliquefaciens (Нейтраза, «Новозаймс», Дания).

Ферментативный гидролиз белков проводили следующих условиях: готовили 0.5-1.0% раствор соответствующего белка в 0.1 М универсальном буфере, рН 7.0, добавляли 0.1 % нейтральную протеиназу. Смесь перемешивали и выдерживали в течение определенного времени в термостате при температуре 30⁰С. После этого из смеси отбирали по 2 мл пробы и добавляли по 2 мл ТХУК (трихлоруксусная кислота) для остановки ферментативной реакции. Затем отстоявшиеся растворы фильтровали через бумажный фильтр и отбирали по 1 мл фильтрата. К фильтратам добавляли по 5 мл 0.5 М раствора углекислого натрия, и перемешивая добавляли по 1 мл рабочего раствора Фолина. Немного отстоявшиеся растворы приобретают голубую окраску, интенсивность которой определяли на фотоэлектроколориметре (670 нм) против контрольной пробы в кюветах с толщиной слоя 10 мм. Содержание продуктов гидролиза (Р) определяли по калибровочной кривой, построенной по тирозину [13].

В ходе ферментативного гидролиза белков в течение определенного времени из реакционной смеси отбирали по 5 мл пробы нагревали на водяной бане и выдерживали в течение 5-10 мин для инактивации фермента. Затем фильтровали через бумажный фильтр и изучали антимикробную активность.

Антимикробную активность определяли с использованием метода диффузии в агар [11]. Растворы испытуемых образцов в объеме 150 мкл закапывали в четыре лунки каждой из трех взятых чашек с бактериями и грибами. Для проверки антибактериального и антифунгального действия использовали культуры: Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa, Грам «+» Staphylococcus aureus и Вacillus subtilis, а также дрожжевая культура Candida albicans сохраняемые в лаборатории «Коллекция промышленно важных микроорганизмов» Института микробиологии АН РУз. Бактерии выращивали на среде (пептон ферментативный – 10 г, натрия хлорида – 5 г, глюкоза – 1 г, агар микробиологический – 13 г., мясная вода 1000 мл) при 37^оС в течение 24-36 часов, культуры Сandida albicans – на жидкой среде (пептон ферментативный – 10 г, глюкоза - 40 г, агар микробиологический - 13 г, дистиллированная вода 1000 мл), после инкубации в термостате измеряли среднюю величину диаметров зон угнетения роста тест-микробов.

Результаты и их обсуждение. Из литературных источников известно, что ферментативным гидролизом растительных белков можно получить пептиды с различным спектром действия. Так, например, из белков семян рапса и хлопчатника путем ферментативного гидролиза получены пептиды, обладающие антиоксидантными и антитромботическими свойствами [1;10;12].

При этом важное значение приобретают тип используемых ферментов. Так, из белков семян хлопчатника, путем ферментативного гидролиза глобулина нейтральной протеиназой, получены высоко активные пептиды с антиоксидантными свойствами [1].

В таблице 1 представлена скорость образования продуктов ферментативного гидролиза водорастворимых и солерастворимых белков, выделенных из зерна амаранта нейтральной протеиназой. При этом показано, что образования продуктов гидролиза увеличивается с продолжительностью времени ферментации.

Таблица 1.

Образование продуктов гидролиза белков в зависимости от времени ферментации

*- продукты гидролиза в мкмоль/мл.

Спектр антимикробной активности различных пептидов, описанных в литературе достаточно широк и включает как нитчатые, так и дрожжеподобные грибы. В ряде случаев показано ингибирование роста бактерий. Так, пептиды амаранта Ac-AMP1 и Ac-AMP2 ингибируют рост грамположительных бактерий, хотя неактивны в отношении тестированных грамотрицательных бактерий [3].

В связи с вышесказанным, дальнейшие исследования были направлены на изучение антимикробной активности пептидов, полученных из белков семян амаранта.

В таблице 2 представлены результаты исследования антимикробной активности продуктов гидролиза белков на подавление роста некоторых патогенных микробов. Из представленных данных видно, что зона подавление роста наблюдаются только у тест-культур S.aureus и В.subtilis.

Таблица 2.

Антимикробная активность продуктов гидролиза белков семян амаранта

Многие испытанные образцы в разной степени подавляют рост Pseudomonas aeruginosa, наиболее высокое значение отсутствия роста наблюдается в присутствии продуктов гидролиза дробленного амарантового зерна с нейтральной протеиназой. При этом среднее значение диаметра зоны подавления составляет 1.8±0.02 см. (рис.1).  Пептиды, полученные в результате гидролиза альбумина с нейтральной протеиназой также подавляют рост S. aureus   в диаметре 1.2±0.1см. (рис.2). На остальных исследованных чашках с тест-культурами подавления роста не обнаружено.

Рисунок 1. Зоны подавления роста Pseudomonas aeruginosa в присутствии пептидов, полученных протеолизом из зерна амаранта

(1-дробленное амарантовое зерно; 2-амарантовая дробина после обработки протеолитическими и амилолитическими ферментами; 3- амарантовый жмых, полученный после прямой экстракции липидов; 4-обезжиренная мука амаранта; 5-альбумин выделенный из муки амаранта; 6-глобулин выделенные из муки амаранта; 7-глютелины выделенные из муки амаранта; 8-антибиотик цефозалин с концентрацией 1мг/мл; 9’-контрольная проба (Буфер рН 7,0 + фермент нейтраза).

Рисунок 2. Зоны подавления роста Staphylococcus aureus в присутствии пептидов, полученных протеолизом из зерна амаранта (обозначение так же, как рис.1.)

Рисунок 3. Зоны подавления роста Вacillus subtilis в присутствии пептидов, полученных протеолизом белков из зерна амаранта (обозначение так же, как рис.1.)

Как видно из данных таблицы и рисунка, дробленное амарантовое зерно проявил активность одновременно против Грам «+» штаммов S.aureus и В.subtilis, подавив рост тест-культур на 18 и 14 мм, соответственно. Минимальную активность (12 мм) проявил также альбумин выделенный из муки амаранта против S.aureus.

Высокую активность против Грам «-» P. аeruginosa проявили также другие образцы с зоной подавления роста от 12 до 18мм.

Заключение. С применением различных ферментов из одного источника амарантового белка получены пептиды с антимикробными свойствами по отношению к некоторым патогенным микроорганизмам, в частности, к Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus и Вacillus subtilis, что создает предпосылку для дальнейшего изучение механизма их действия для создания пептидных антибиотиков и антимикотиков нового поколения в медицинских целях.

Список литературы:

1. Boboev A., Hasanov A., Yotova L., Hasanov H. Antioxidant Activity of Peptides Obtained from Wheat and Cottonseed Proteins//Bulgarian Journal of Agricultural Science. -2012.-V.18,- N.1., -P.103-111.
2. Broekaert W.F., Cammue B.P.A., Debolle M.F.C., Thevissen K., Desamblanx G.W., Osborn R.W. Antimicrobial peptides from plant. // Crit. Rev. Plant Sci. 1997.- V.16. -P.297–323.
3. Broekaert W.F., Mariën W., Terras F.R.G., De Bolle M.F.C., Proost P., Van Damme J., Dillen L., Claeys M., Rees S.B., Vanderleyden J., Cammue B.P.A. // Antimicrobial peptides from Amaranthus caudatus seeds with sequence homology to the cysteine-glycine-rich domain of chitin-binding proteins. Biochemistry. 1992. V. 31. P. 4308-4314.
4. Buţu M., Buţu A. Antimicrobial peptides – natural antibiotics//Romanian Biotechnological Letters, 2011.-V. 16.- No. 3.- Р. 6135-6145.
5. Carvalho A.O., Gomes V.M. // Plant defensins–prospects for the biological functions and biotechnological properties. Peptides. 2009. V. 30. P. 1007-1020.
6. Korhonen H., Pihlanto A. Bioactive peptides: Production and functionality // International Dairy Journal. – 2006. – V. 16. – P. 945–960.
7. Lay F.T., Anderson M.A. // Defensins--components of the innate immune system in plants. Curr Protein Pept Sci. 2005. V. 6. P. 85-101.
8. Marshall S.H., Arenas G. Antimicrobial peptides: A natural alternative to chemical antibiotics and a potential for applied biotechnology//Electronic Journal of Biotechnology 2003. -V.6. -No.2. -Issue, -Р. 271-284.
9. Terras F.R.G., Eggermont K., Kovaleva V., Raikhel N.V., Osborn R.W., Kester A., Rees S.B., Torrekens S., VanLeuven F., Vanderleyden J., Cammue B.P.A., Broekaert W.F. // Small cysteine-rich antifungal proteins from radish: their role in host defense. Plant Cell. 1995. Vol. 7. P. 573-588.
10. Zhang Sh.B.,. Wang Z .,  Xu Sh.Y.  Antioxidant and Antithrombotic Activities of Rapeseed Peptides//J. Am. Oil. Chem. Soc. -2008, -V., -P.521–527.
11. Государственная фармакопея российской федерации. Издательство "Научный центр экспертизы средств медицинского применения".- Москва, 2007.-С.194.
12. Егоров Ц.А., Одинцова Т.И. Защитные пептиды иммунитета растений// Биоорганическая химия, -2012, -т. 38, -№ 1, -С.7–17.
13. Препараты ферментные. Метод определения протеолитической активности. М.: 1985. ГОСТ 20264.2-85.