Антиоксидантная активность пептидов полученных из белков шрота хлопчатника

АННОТАЦИЯ

Изучена антиоксидантная активность пептидов полученных из белков хлопковой мятки и шрота хлопчатника путем их ферментативного гидролиза с кислыми (Asp. niger) и нейтральными протеиназами (Bac. amyloliquefaciens). Антиоксидантная активность полученных пептидов зависит от используемых белков и ферментов. Пептиды полученные при помощи нейтральной протеиназы обладают более высокой антиоксидантной активностью, по сравнению с пептидами, полученными  с помощи кислых протеиназ.

ABSTRACT

Antioxidant activity of the peptides derived from proteins of defatted cottonseed kernels and cotton ground oil-cake by their enzymatic hydrolysis with acidic (Asp. niger) and neutral proteinases (Bac. amyloliquefaciens) was studied. Antioxidant activity of the derived peptides depended on the used proteins and enzymes. The peptides derived by using of neutral proteinase possessed higher antioxidant activity, in comparison with the peptides derived by acidic proteinases.

Ключевые слова: Белки, шрот хлопчатника, гидролиз, кислая и нейтральная протеиназа, антиоксидантная активность.

Keywords: Proteins, cotton ground oil-cake, hydrolysis, acid and neutral protease, peptides, antioxidant activity.

Антиоксиданты представляют собой важную группу пищевых добавок, которые обладают способностью защищать от вредного изменения окисляемых питательных веществ и, следовательно, увеличивают срок годности пищевых продуктов [1].

Для увеличение срока хранения готовых продуктов используются различные природные и синтетические консерванты и антиокислители. При этом большое внимание уделяется применению природных антиоксидантов на основе полифенолов [9,10,14,15] и пептидов, получаемых из растительного сырья [2,3,6].

Некоторые активные пептидные антиоксиданты и пептиды утилизирующие свободные радикалы идентифицированы в различных гидролизатах белков, таких как яичный альбумин [6], белок из сои [4], белки молока, такие как α-лактатальбумин и β-лактоглобулин [7,12] и др.  

В работе [8] изучено влияние различных ферментных препаратов на ферментативный гидролиз обезжиренных ядер арахиса с целью получения антиоксидантных пептидов. Гидролизаты, полученные с помощью эсперазы имели более высокую антиокислительную активность по сравнению с нейтразой, пепсином, протеазой А и протеазой N, когда критерием оценки служила окисляемость линолевой кислоты. Молекулярная масса пептидов, полученных  с помощью эсперазы, составила от 3 до 5 кД. Антиокислительная  активность была в 3 раза выше, чем у аскорбиновой кислоты.

Хлопчатник является одной из важнейших масличных культур в Узбекистане. Основным побочным продуктом процесса экстракции масла из семян хлопчатника является шрот хлопчатника, который имеет относительно высокое содержание белка 35-40%, что делает его привлекательным и многообещающим источником растительных белков. Тем не менее, наличие анти-питательных веществ является одним из основных недостатков в использовании биосырья в качестве пищи для человека. Следовательно, оно, как правило, используется в качестве корма для животных.

Целью данной работы являлось изучение антиоксидантной активности пептидов полученных из белков шрота хлопчатника.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовали, нейтральную протеиназу (Нейтраза) и кислую протеиназу (Пролайв PAC 30L) производимые фирмой «Новозаймс», Дания.

В качестве белковых субстратов использовали водорастворимые и солерастворимые (10% NaCI) белки из хлопковой мятки и шрота хлопчатника.

2.1 Ферментативный гидролиз изолированных белков шрота хлопчатника.

Готовили 1% раствор соответствующего белка в 0,1 М универсальном буфере рН 2,8 в случае использования кислой протеиназы и рН 7,0 в случае использования нейтральной протеиназы. Ферментативный гидролиз проводили при температуре 37^оС. Содержание продуктов гидролиза (Р) определяли по калибровочной кривой, построенной по тирозину [13].

2.2. Определение продуктов гидролиза углеводов. К ферментированному маслу добавляли равный объем дистиллированной воды и после тщательного перемешивание центрифугировали при 5000 об/мин в течение 10 мин, отделяли водную часть и определяли содержание восстанавливающих сахаров по методу Нельсона и Шомоди [5].

2.2 Подготовка образца пептидов. В ходе ферментативного гидролиза белков в течение 6 часов из реакционной смеси отбирали по 5 мл пробы, нагревали  на водяной бане и выдерживали в течение 5-10 мин для инактивации фермента. Затем фильтровали через бумажный фильтр и изучали их антиоксидантную активность по скорости окисления (+)-катехина.

2.3 Измерение скорости окисления (+)-катехина [11]. Реакционная среда в 0,1 М ацетатном буфере (рН 4,2 ) содержала 4 мМ (+)-катехина, 20 об % этанола и 10 мг/л FeCI₃. Содержание пептидов в 10 мл реакционной среды составляло 0,4 мкмоль. Реакционную смесь инкубировали в термостате при температуре 40⁰ С в течение 15 дней. Каждый день измеряли оптическую плотность раствора на фотоколориметре при длине волны 440 нм.

3. РЕЗУЛЬТАТЫИ ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что содержание белков в ядре семян хлопчатника колеблется в пределах 25-38%. При этом альбумин и глобулин составляют 90% от общего количество белков.

Эти белки c различной скоростью гидролизуются кислыми и нейтральными протеиназами.

В таблице 1 приведено сравнение скорости гидролиза водорастворимых и солерастворимых белков, выделенных из хлопковой мятки и шрота хлопчатника.

Из представленных данных видно, что начальная скорость гидролиза альбумина и глобулина из хлопковой мятки кислой протеиназой почти одинакова. В случае нейтральной протеиназы альбумин наиболее сильно подвергается ферментативному гидролизу и скорость гидролиза составляет 0,4 мкмоль/час, а глобулин напротив - 0,26 мкмоль/час.

Термическая обработка мятки, способствует  изменению гидролизуемости белков. Так, скорость гидролиза альбумина  кислой и нейтральной  протеиназой уменьшается в 8-9 раз и составляет 0.07 мкмоль/час и 0,05 мкмоль/час, соответственно. Глобулин выделенный из шрота хлопчатника становится более уязвимым к кислым и нейтральным протеиназам. Скорость его гидролиза кислыми и нейтральными протеиназами составляет 0,8 и 0,62 мкмоль/час, соответственно.

Таблица 1

Скорость гидролиза белков выделенных из хлопковой мятки и шрота хлопчатника (мкмоль/час) кислой и нейтральной протеиназой

Состав реакционной среды: содержание белка -1%, температура -37^оС,

рН 7,0 в случае нейтральной протеиназы и рН      

2,8 в случае кислой протеиназы.

Следует отметить, что при переработке семян хлопчатника, согласно традиционной технологии, имеется множество факторов, отрицательно влияющих на каталитические свойства ферментов.

Нежелательные продукты, образующиеся  в таких условиях отрицательно влияют ферментативные процессы. При этом тепло воздействует как на белки, так и на другие органические вещества. Углеводы также подвергаются воздействию тепла, с протеканием реакции меланоидинообразования.

Для удаления сопутствующих веществ нами проведена предварительная обработка шрота хлопчатника амилолитическими ферментами для гидролиза углеводов с последующим удалением продуктов гидролиза путём промывания.

В таблице 2 приведена скорость образования восстанавливающих сахаров при ферментативной обработке хлопковой мятки и шрота хлопчатника амилолитическими ферментами.

Таблица 2

Скорость образования восстанавливающих сахаров при ферментативном гидролизе углеводов хлопковой мятки и шрота хлопчатника

Состав реакционной среды: содержание хлопковой мятки (или шрота хлопчатника)- 3%, рН среды 5,6, температура – 50^оС, концентрация фермента по 0,1%.

Начальная скорость образования восстанавливающих сахаров при ферментации хлопковой мятки α-амилаза составляет 0,3 мг/час. При совместном  использовании α-амилазы β-амилазы скорость гидролиза углеводов протекает интенсивнее и образование восстанавливающих сахаров составляет 0,5 мг/час. При ферментации шрота хлопчатника углеводы в меньшей степени подвергаются ферментативному гидролизу и скорость образования восстанавливающих сахаров составляет 0,05 мг/час в случае использования α-амилазы и 0,2 мг/час в случае совместного использования α- и β-амилаз. Низкую активность амилаз по отношению к углеводам шрота хлопчатника можно объяснить ингибирующим влиянием сопутствующих веществ, образующихся во время тепло влажностной обработки хлопковой мятки.

Несмотря на это, при очистке шрота хлопчатника от сопутствующих веществ, используя амилолитические ферменты можно удалить определенное количество углеводов и сопутствующих веществ. При этом, важное значение приобретает также значение рН промывной воды.

Для удаления сопутствующих веществ нами проведена предварительная промывка хлопкового шрота водой с различными значениями рН среды (табл.3).

Из представленных данных видно, что промывка хлопкового шрота горячей водой с рН 9,0  даёт наилучшие результаты. При этом гидролизуемость белков увеличивается в 1,4-1,7 раза по сравнению с водой со значениями рН 3,5 и 7,0.

Таблица 3

Влияние условий промывки шрота хлопчатника на гидролизуемость белков

На рис. 1 показано влияние ионов хлористого натрия на активность кислых и нейтральных протеиназ при гидролизе белков хлопкового шрота.

Рисунок 1.   Влияние хлористого натрия на активность кислых (1) и нейтральных (2) протеиназ при гидролизе белков хлопкового шрота

Ионы хлористого натрия положительно влияют на активность кислых протеиназ. Скорость гидролиза белков шрота хлопчатника при концентрации NaCI  3%, увеличивается в 1,3-1,4 раза. При такой концентрации нейтральная протеиназа теряет 50% активности.

Продукты гидролиза белков, выделенных из хлопковой мятки и шрота обладают разными антиоксидантными свойствами. Антиоксидантная активность пептидов полученных из мятки и шрота приведена на рис. 2.

Рисунок 2. Влияние пептидов полученных из глобулина, выделенных из хлопковой мятки (а) и шрота хлопчатника (б) на скорость окисление (+)-катехина.

1-контроль, 2- пептиды полученные с кислой протеиназой, 3-пептиды полученные с нейтральной протеиназой.

Из представленных данных видно, что снижение скорости окисления (+)-катехина наблюдается со всеми образцами пептидов.  Существенную разницу можно видеть в случае с пептидами полученными при гидролизе глобулина различными ферментами. Продукты гидролиза глобулина кислыми протеиназами обладают меньшей антиоксидантной активностью и скорость окисления (+)-катехина в модельных системах уменьшается незначительно (рис. 2а, кривая 2) по сравнению с контролем.

Наиболее высокой антиоксидантной активностью обладали пептиды, полученные с применением нейтральных протеиназ (рис. 2б, кривая 3). Из представленных данных видно, что снижение скорости окисления (+)-катехина намного ниже чем, в случае когда в среде присутствовали пептиды, полученные из глобулина при помощи кислой протеиназы.

Таким образом, белки хопкового шрота могут быть использованы для получения пептидов с антиоксидантными свойствами.

Заключение

Ферментативный гидролиз белков хлопковой мятки и щрота кислой и нейтральной протеиназами приводит к получению пептидов с различными антиоксидантными свойствами. Было показано, что антиоксидантная активность пептидов зависит от типа протеолитического фермента.

В случае глобулина из хлопкового шрота, антиоксидантная активность пептидов, полученных с использованием нейтральной протеиназы в 2-3 раза выше, чем пептидов, полученных с использованием кислой протеиназы. Во всех случаях, пептиды, полученные с использованием кислой протеиназы,  в меньшей степени снижают скорость окисления (+) - катехина.

Список литературы: