Комплексная переработка семян амаранта с использованием гидролитических ферментов

АННОТАЦИЯ

С целью эффективного использования биополимеров семян амаранта были изучены процессы получения пептидов антиоксидантными свойствами из белков амаранта и сахаристых веществ из крахмала с использованием протеолитических и амилолитических ферментов. Показано, что из белков амаранта под действием нейтральных протеиназ можно получать пептиды с различными антиоксидантными свойствами, а также сахаристых веществ из крахмала. На основании полученных результатов была создана принципиальная схема комплексной переработки семян амаранта.

ABSTRACT

With a view to the effective use of biopolymers of amaranth seeds, the processes for producing peptides with antioxidant properties from amaranth proteins and sugary substances from have been studied starch using proteolytic and amylolitic enzymes. It has shown that it is possible to produce peptides with various antioxidant properties, as well as sugary substances from starch, from amaranth proteins under the action of neutral proteinases. On the results, a principal scheme for the integrated treatment of Amaranth seeds was established.

Ключевые слова: амарант, белок, крахмал, гидролиз, фермент, амилаза, протеиназа, пептиды, сахаристые вещества.

Keywords: amaranth, protein, starch, hydrolysis, enzyme, amylase, proteinase, peptides, sugar substances.

В последние годы большое внимание уделяется переработке семян амаранта для получения биологически активных веществ [5]. Это связано с тем, что по составу семена амаранта представляет собой сырье, богатое биологически активными веществами, белками, крахмалом, витаминами (витамины A, В1, В2 и C) и минеральными веществами по сравнению со другими зерновыми культурами. Отдельное место по аминокислотному составу занимает его протеиновый состав. Белки амаранта имеют более сбалансированный аминокислотный состав и, следовательно, более высокая биологическая ценность, чем у большинства злаков [1].

Масло семян амаранта имеет особое значение из-за его биологических свойств. Масло семян амаранта состоит из 46% жирных кислот Омега-6, 5% Омега-3 и 23% Омега-9. Однако, он содержит 8-10% сквалена, обладающего антиоксидантными и бактерицидными свойствами [2].

В последние годы большое внимание уделяется переработке семян амаранта с целью получения амарантного масла и биологически активных веществ. Семена амаранта содержат 6-7% жира, который в основном добывается холодным прессованием и экстракцией. Высокое давление при производстве амарантового масла при прессовании вызывает нагревание сырья и таким образом снижению биологической ценности компонентов семян амаранта.

Целью данного исследования было изучение влияния гидролитических ферментов на процесс получения пептидов с антиоксидантными свойствами и сахаристых веществ из крахмала.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2. Материалы и методы

2.1. Материалы.

В работе использовались семена амаранта сортов «Харьковский», «Гигантский» и «Золотой Гигантский», выращенного в Хорезмской области Узбекистана.

В качестве протеолитических ферментов использовали нейтразу (Novozymes (Дания) из Bacillus amyloliquefaciens) и кислую протеиназу Prolive PAC 30L (EnzymeBioProduct Ltd, Россия) из гриба Aspergillus niger.

В качестве амилолитических ферментов использовали α-амилазу (Амилек 3Т, ООО «Экспо Текс», Россия) и β-амилазу (ДиазимХ4, ООО «Экспо Текс», Россия).

В качестве белкового субстрата использовали водорастворимые белки (альбумины), экстрагированные из семян амаранта в лабораторных условиях, белки, растворимые в 10% растворе NaCl (глобулины), белки, растворимые в 80% спирте (проламины), и белки, растворимые в 0,2% растворе NaOH (глютелины).

2.2. Ферментативный гидролиз белков. 

 Готовили 1% раствор соответствующего белка в 0,1 М универсальном буфере (рН 7,0 в случае нейтральных протеиназ и рН 2,5 в случае кислых протеиназ), добавляли 0,1 % нейтразы. Смесь перемешивали и выдерживали в течение определенного времени в термостате при температуре 30⁰С, после чего взяли по 2 мл пробу добавляли по 2 мл ТХУК (трихлоруксусная кислота) для остановки ферментативной реакции. Затем, отстоявшиеся растворы фильтровали через бумажный фильтр и отбирали по 1 мл фильтрата, добавляли по 5 мл 0,5 М раствора углекислого натрия. Перемешивая, добавляли по 1 мл рабочего раствора Фолина. Немного отстоявшиеся растворы приобретают голубую окраску, интенсивность которой определяли на фотоэлектроколориметре (при длине волн 670 нм) против контрольной пробы в кюветах с толщиной слоя 10 мм [9]. Содержание продуктов гидролиза (Р) определяли по калибровочной кривой, построенной по тирозину.

2.3. Подготовка образца пептидов. В ходе ферментативного гидролиза белков в течении определенного времени из реакционной смеси отбирали по 5 мл пробы и нагревали в водяной бане и выдерживали в течении 5-10 мин. для инактивации фермента. Затем фильтровали через бумажный фильтр
и изучали их антиоксидантную активность продуктов гидролиза.

2.4. Определение антиоксидантных свойств пептидов.

Антиоксидантную активность пептидов оценивали по скорости окисление (+)-катехина ионами железа при высоких температурах в присутствии и отсутствии пептидов. Реакционная среда в 0,1 М ацетатном буфере рН 4,2 содержала 4 мМ (+)-катехина, 20 об% этанола и 10 мг/л FeCI₃. Содержание пептидов в 10 мл. реакционной среды составляло 0,2 мл. Реакционную смесь инкубировали в термостате при температуре 45^оС в течении 15 дней. Каждый день измеряли оптическую плотность раствора на фотоэлектроколориметре при длине волны 440 нм [6]. На основании полученных результатов оценивали степень снижения скорости окисления (+)-катехина.

2.5. Осахаривание крахмала семян амаранта.

После протеолитической обработки 200 г. муки семян амаранта образовавшихся продукты реакции отделяли фильтрованием и осадок дважды промывали водой. Затем к осадку добавляли 500 мл. дистиллированной воды и значение pH среды довели до 5,6 с помощью соляной кислоты. Затем поместили смесь в термостойкий стакан и добавили 0,3 мл ферментого раствора α-амилазы (Amilek 3T). При перемешивании температуру замеса повысили до 85 °С и выдерживали при этой температуре 30 мин. Затем снизили температуру смеси до 50-53 °С и добавили 0,2 мл фермента β-амилазы (Диазим X4). При этой температуре выдерживали в течении 30 мин. Полученную осахаренную жидкость отделяли фильтрованием и измеряли содержание сухих веществ раствора рефрактометрическим способом, и редуцирующие вещества по методике [8].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ

В последнее время среди многочисленных антиоксидантов различного происхождения используемых в пищевой промышленности большой интерес приобретают пептидные антиоксиданты [10].

Многими исследователями показано, что пептидные антиоксиданты можно получить путем ферментативного гидролиз различных белков. Так например, некоторые активные пептидные антиоксиданты и пептиды утилизирующие свободные радикалы идентифицированы в различных гидролизатах белков, такие как яичный альбумин [4], белок из сои [3], белки молока, такие как α-лактаталбумин и β-лактоглобулин [7] и др.

Одним из основных преимуществ является то, что применением различных ферментов из одного источника белка можно получить пептиды с разными свойствами.

Семена амаранта также являются ценным сырьем для получения разных биологически активных веществ [2]. Ниже приводятся некоторые подходы решения проблемы переработки семян амаранта с использованием гидролитических ферментов.

Получение антиоксидантных пептидов из белков семян амаранта.

В семенах амаранта обнаружены водорастворимые белки (альбумины), 3-10% солерастворимые белки (глобулины), 60-80% спирторастворимые белки (проламины) и 0,2% щелочно растворимые белки. Количественный состав белков, содержащихся в некоторых семенах злаковых, приведен в таблице 1.

Таблица 1.

Белковый состав семян зерновых культур (% от сухого вещества)

Из данных, приведенных в таблице, видно, что семена амаранта также содержат все белковые вещества, как и другие зерновые культуры. Содержание альбумин, глобулина, проламина и глютелина в семенах амаранта составляет 19, 38, 13 и 19%, соответственно.

Эти белки с разной скоростью гидролизуются с протеолитическими ферментами. В таблице 2 показана активность протеолитических ферментов, полученных из различных источников.

Таблица 2.

Активность кислых и нейтральных протеиназ

Данные таблицы показывают, что активность нейтральной протеиназы в 5 раз превышает активность кислой протеиназы и составляет 860 ед/г.

Другие белки семян амаранта также гидролизуются с разной скоростью указанными ферментами. Полученные результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3.

Скорость гидролиза различных белков семян амаранта с кислыми и нейтральными протеиназами

Из представленных данных видно, что из белков семян амаранта глютелин наиболее высокой скоростью гидролизуется с кислой и нейтральной протеиназой. Скорость гидролиза указанных белков составляет 0,8 и 0,62 мкмоль/час. Наиболее низкой скоростью гидролизуется альбумин и глобулин. Скорость гидролиза указанных белков с кислой протеиназой меньше в 4 раза по сравнению с нейтральной протеиназой. Гидролиз проламина и глютелина нейтральной протеиназой не дал резких отличий от кислой протеиназы.

В дальнейших исследованиях мы изучали антиоксидантную активность полученных пептидов. Антиоксидантные свойства пептидов, полученных из белков семян амаранта, представлены на рис.1.

Рисунок 1. Влияние пептидов на скорость окисление (+)-катехина в присутствии пептидов полученных нейтральной протеиназой

1-контроль, 2-4 - в присутствии пептидов полученных из альбумина, глобулина и глютелина, соответственно.

Из представленных данных видно, что оптическая плотность раствора в результате окисления (+) - катехина при 45 °С за 10 суток в присутствии ионов железа составляет 1,3 единицы (рис. 1, кривая 1). При добавлении пептидов (+) -скорость окисления катехинов снижается. В частности, пептиды, полученные из глобулина и глютелина, замедляют процесс, и оптическая плотность раствора составляет всего 0,5-0,6 единиц.

Таким образом, на основе белков семян амаранта можно получить пептиды с антиоксидантными свойствами.

В следующей части нашего исследования мы проанализировали процесс осахаривания оставшегося крахмала после гидролиза белков семян амаранта.

Получение сахаристых веществ из крахмала семян амаранта. После ферментативного удаления белков семян амаранта 60-65% крахмала остается в составе осадка. Для их эффективного использования исследовали процессы превращения крахмала на сахаристые вещества под действием амилолитических ферментов. В качестве фермента использовали микробные ферменты.

Для этого к осадку после промывки водой добавляли дистиллированную воду в соотношении 1:2,5. Затем, постоянным перемешиванием добавляли 0,3 мл α-амилазу и начали нагревать со скоростью 1^оС в минуту. Нагревали до до 85°C и выдерживали при этом температуру 30 мин. После полного гидролиза крахмала смесь охлаждали до температуры 50-53°C, добавляли β-амилазу и выдерживали при этой температуре в течение 30 минут. Затем полученный осахаренный раствор отфильтровывали. Химический анализ полученного осахаренного раствора приведены в таблице 4.

Таблица 4.

Содержание восстанавливающих сахаров полученного из амарантового крахмала

 На основании полученных результатов рекомендуется следующая принципиальная схема переработки семян амаранта (рис.2).

Рисунок 2. Принципиальная схема комплексной переработки семян амаранта.

Таким образом, путем ферментативной обработки семян амаранта в определенной последовательности можно получить из белков пептиды с антиоксидантными свойствами и сахаров из крахмала. Отходом является твердые остатки содержащие липиды, из которых можно извлечь липиды методом экстракции.

Список литературы:

1. Avanza MV, Puppo MC. Structural characterization of amaranth protein gels. J Food Sci. 2005, 70:223–9. DOI: 10.1111/j.1365-2621.2005.tb07139.x.
2.  Caselato-Sousa VM, Amaya-Farf.an J State of knowledge on amaranth grain: a comprehensive review. J Food Sci. 2012, P.77:93–104.
3. Chen, H. M., Muramoto, K., & Yamauchi, F. Structural analysis of antioxidative peptides from soybean b-conglycinin. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1995, 43, P.574–578.
4. Davalos A., Miguel M., Bartolome B., & Lopez-Fandino R. Antioxidant activity  of peptides derived from egg white proteins by enzymatic hydrolysis// Journal of Food Protection, 2004, 67, P.1939–1944.
5. Montoya-Rodr.ıguezA., Mario A.A., Identification of Bioactive Peptide Sequences from Amaranth (Amaranthushypochondriacus) Seed Proteins and Their Potential Role in the Prevention of Chronic Diseases//Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2015, Vol.14, P.139-158.
6. Oszmianski J., Cheynier V., Moutounet M. Iron-catalyzed oxidation of (+)-catechin in model systems. J.Agric.Food Chem. 1996, 44, P.1712-1715.
7. Pihlanto, A. Antioxidative peptides derived from milk proteins// International Dairy Journal, 2006, 16, P.1306–1314.
8. Патока крахмальная. Технические условия. Издательство стандартов. М.1992. ГОСТ 5194-91.
9. Препараты ферментные.  Метод определения протеолитических активности. М., 1985, ГОСТ 20264.2-85.
10. Walther B. Sieber R.. Bioactive proteins and peptides in foods // International Journal for Vitamin and Nutrition Research. -2011. –Vol.81. – P.181–191.