Целлюлолитические активности почвенных и сапротрофных грибов и их специфичности к целлолозным субстратам

АННОТАЦИЯ

Методами поверхностного культивирования на целлюлозосодержащей среде, внесенной в состав питательной среды в качестве единственного источника углерода, были оценены целлюлолитические активности более 150 почвенных и сапротрофных грибов, относящихся к различным родам и видам, среди которых 78 представителей показали большие зоны гидролиза целлюлозы. Источниками выделения грибов были почвы различных регионов Республики Узбекистан и вегетативные части больных растений. Далее методами глубинного культивирования на среде с целлюлозой, внесенной в состав среды в качестве единственного источника углерода концентрации 2,0 %, отобраны наиболее активные 28 культур грибов. Более углубленные исследования целлюлазной активности отобранных культур позволили выбрать 8 культур грибов. Было установлено, что они обладают различными активностям в отношении гидролиза хлопковой, древесной целлюлозы и карбоксиметилцеллюлозы. Активности грибов зависят от времени культивирования грибов и видов субстратов, используемых в реакционной смеси в качестве субстрата. Отобраны наиболее целлюлолитически активные представители почвенных и сапротрофных грибов, имеющие большое значение в сельском хозяйстве и промышленности.

ABSTRACT

The cellulolytic activities of more than 150 microscopic fungi belonging to various genera and species were assessed by surface cultivation on a cellulose-containing medium, introduced into the nutrient medium as the only carbon source, among which 78 representatives showed large zones of cellulose hydrolysis. regions of the Republic of Uzbekistan and vegetative parts of diseased plants. Further, by methods of submerged cultivation on a medium with cellulose introduced into the medium as the only carbon source with a concentration of 2.0%, the most active 28-cultures of fungi were selected. More in-depth studies of the cellulase activity of the selected cultures made it possible to select 8-cultures of mushrooms. It has been found that they have different activities in relation to the hydrolysis of cotton, wood cellulose and carboxymethyl cellulose. The activity of the fungi depends on the cultivation time of the fungi and the types of substrates used in the reaction mixture as a substrate. The most cellulolytically active representatives of soil and saprotrophic fungi, which are of great importance in agriculture and industry, were selected.

Ключевые слова: почвенные грибы, сапрофиты, скрининг, целлюлаза, субстрат, отбор, специфичность, спектр ферментов, активности.

Keywords: soil fungi, saprophytes, screening, cellulases, substrates, selection, specificity, spectrum of enzymes, activities.

Введение. Весьма широка группа почвенных грибов, основное местообитание которых – почва, участвующих в разложении (минерализации) органического вещества, образовании гумуса и т.п. Близки к ним грибы, разрушающие лесную подстилку: опавшие листья, гнили. К ним относятся также и шляпочные грибы – подстилочные сапротрофы и некоторые другие [1]. В группах почвенных грибов выделяются постоянно: обитатели почвы – грибы, попадающие туда только в определенный период жизни (главным образом патогенные для животных и растений виды), а также грибы – ризосферы растений, живущие в зоне их корневой системы. Особую группу составляют ксилофиты – грибы, разлагающие древесину [2]. Среди них различают разрушителей живой древесины и питающихся мертвой древесиной (опавшие сучья, порубочные остатки и т.п.). Характерна группа домовых грибов – разрушителей деревянных частей построек [4].

Грибы – паразиты растений – четко выраженные группы, среди которых можно различить микотрофные грибы (паразитирующие на грибах), паразиты высших растений, водорослей. В процессе сопротивления паразитам возникла группа микоризных грибов-симбионтов, т.е. сожителей с разными видами высших растений.

Существуют специфические экологические группы грибов, развивающихся на различных промышленных материалах, изделиях и вызывающих их повреждения, а также группы грибов, живущих на бумаге и изделиях из нее (книги, рукописи и т.п.), содержащие целлюлозу, которые обладают также активностью против фитопатогенов [3; 5; 6].

Обоснование исследований. Изучение ферментной системы почвенных грибов, гидролизующих лигноцеллюлозные отходы, попадающие в почву и являющиеся актуальными и востребованными как при оценке биологической активности и обогащения почвы, биоконверсии и утилизации растительных отходов, так и в борьбе с фитопатогенами и вредителями растений.

Поэтому нами был проведен обширный скрининг более 150 штаммов музейных культур почвенных микроскопических грибов, хранившихся в лаборатории «Коллекции микроорганизмов» ИМБ АН РУз и в лаборатории ферментов микроорганизмов, относящихся в основном к родам Fusarium (42 культуры), Aspergillus (37 культур), Penicillium (51 культура) и некоторые сапрофитные культуры грибов (21 культура), выделенные из больных листьев, стеблей растений. Музейные культуры хранили на агаризованной среде сусло-агар и Чапек-агар.

Методы исследований. Первичную оценку гидролизующей способности грибов проводили методом поверхностного культивирования на агаризованных средах, содержащих микрокристаллическую целлюлозу (МКЦ) в концентрации 5,0 %, внесенную в состав синтетической питательной среды Чапека в качестве единственного углерода.

Для определения ферментативной активности использовали фильтрат культуральной жидкости (КЖ), взятый из ферментационной среды, через каждые 12 часов роста.

Целлюлазную активность в КЖ определяли по модификации Р.В. Фениксовой [7]. Определяли образующиеся Somogyi-Nelson редуцирующие сахара (РС) при гидролизе 1,0 %-ного раствора н.п. натрий КМЦ (натрий карбоксиметилцеллюлозы) фирмы Sigma (США). Удельную целлюлазную активность выражали на единицу веса (мг) общего белка, содержащегося в КЖ и отщепляющего из субстрата 1 мкг глюкозы, который измеряется при 490 нм волны ФЭК. Белок – по общепринятому методу Лоури [8]. Определение субстратной специфичности проводили с использованием древесной целлюлозы и обезвоженной хлопковой целлюлозы в оптимальных условиях, описанных по методу Вуд и Бхат.

Результаты исследований и их обсуждение. Методом поверхностного культивирования на целлюлозосодержащей среде из испытуемых 150 представителей грибов по скорости роста в течение 3–7 суток и величине зоны гидролиза субстрата микрокристаллической целлюлозы (МКЦ) были отобраны активные грибы: из рода Fusarium – 8 грибов, Aspergillus – 5 грибов, Penicillium грибов – 7, сапрофитов растений – 8 грибов (табл. 1).

Таблица 1.

Перечень отобранных грибов-целлюлозолитиков

Далее методом глубинного культивирования на среде 2 %-ного МКЦ были определены количество белков и ферментативная активность отобранных грибов в течение 144 часов роста, пробы для анализа отбирали каждые 12 часов.

Максимальное количество белка в КЖ было обнаружено у гриба F. moniliforme–191, P.purpurogenium–159, Acremonium sp. 3, Alternaria sp. 62, Alternaria sр. 76, F.solani–169, F. moniliforme–183, Penicillium sp. 18, Aspergillus terreus–461, A. terreus–499, Ulocladium sp. 134. Во время роста грибов рН в среде увеличился. Высокую активность на среде с 2,0 %-ным МКЦ показали грибы F.solani–169, F.moniliforme–183, P.purpurogenium–159, Penicillium sp. 18, A. terreus–461, A. terreus–499, Ulocladium sp. 134, Alternaria sp. 9.

Было обнаружено, что из отобранных 28 грибов, обладающих большой зоной гидролиза полисахаридов на твердых питательных средах, 8 культур имели наибольшую активность целлюлазы по сравнению с другими культурами.

Далее были проведены исследования по оценке гидролизующей активности грибов на разных целлюлозных субстратах: обезжиренное хлопковое волокно, 1 %-ный р-р NaКМЦ, гомогенная древесная целлюлоза (рис. 1, 2, 3). Определение целлюлазы на 2,0 %-ном хлопковом волокне и древесной целлюлозе проводили в течение 24 ч, инкубацией субстрат : фермент при 20 °С.

Рисунок 1. Активности целлюлазы грибов при гидролизе хлопковой целлюлозы (грибы: Penicillium sp. 18, A. terreus.–499, F. solani–169, Aspergillus. terreus.–461, Ulocladium sp. 134, P.purpurogenum–159, Alternaria sp. 9, F. moniliforme–183)

Было обнаружено, что гидролиз хлопоковой целлюлозы КЖ грибов происходит на 4-е и 5-е сутки роста грибов в различной степени, далее активность фермента уменьшается, на 8-е сутки культивирования гриб A. terreus.–461 проявляет наивысшую активность по гидролизу хлопкового волокна (рис. 1).

Активности КЖ по гидролизу 1 % NaКМЦ проводились после инкубации субстрата с фильтратом грибов (взятые в разные сутки динамики их роста) при 40 °С в течение 30 мин методом Сомоджи – Нельсона (рис. 2).

Рисунок 2. Динамика активности целлюлазы грибов при гидролизе Na-КМЦ (взятые КЖ на среде с 5,0 %-ным МКЦ, внесенной в состав среды в качестве источника углерода (грибы: Penicillium sp. 18, A. terreus.–499, F.solani–169, A. terreus.–461, Ulocladium sp. 134, P. purpurogenum–159,Alternaria sp. 9, F. moniliforme–183)

Было установлено, что почти все грибы обладали большей способностью к гидролизу Na-КМЦ в реакционной смеси начиная с 4-х суток роста грибов, далее активность немного снижается и возобновляется на 8-е сутки роста некоторыми грибами. Высокие показатели по гидролизу данного субстрата имели грибы Aspergillus. terreus.–461, Alternaria sp. 9, Penicillium purpurogenum–159, далее Aspergillus. terreus. –499 и Penicillium sp. 18.

Способности грибов к гидролизу древесной целлюлозы проявляются раньше и больше, чем гидролиз хлопкового волокна. Так, например, грибы A. terreus.–499, A. terreus.–461, далее F. moniliforme–183 на 5-е сутки роста проявляли большую активность по сравнению другими грибами (рис. 3).

Рисунок 3. Активности целлюлазы грибов по гидролизу древесной целлюлозы (грибы: Penicillium sp.–18, A. terreus.–499, F. solani–169, A. terreus.–461, Ulocladium sp. 134, P. purpurogenum–159, Alternaria sp. 9, F. moniliforme–183)

Таким образом, методами поверхностного и глубинного культивирования были оценены целлюлолитические активности более 150 почвенных и сапротрофных грибов, относящихся к различным родам и видам. Методами глубинного культивирования на среде с целлюлозой, внесенной в состав среды в качестве единственного источника углерода концентрации 2,0 %, отобраны 28 активных представителей грибов.

Углубленные исследования целлюлазной активности 8 грибов показали, что они обладают различными, но высокими активностям в отношении гидролиза хлопковой, древесной целлюлозы и карбоксиметилцеллюлозы. Активности грибов зависят от времени культивирования грибов и вида субстратов, используемых в реакционной смеси в качестве субстрата. Отобраны наиболее целлюлолитически активные представители почвенных и сапротрофных грибов, имеющих большое значение в сельском хозяйстве, в области защиты растений и промышленности.

 Список литературы:

1. Иванова А.Е. Жизнеспособность фрагментов мицелия почвенных микроскопических грибов в разных экологических условиях: Автореф. дис. … канд. наук. – М. : МГУ, 1999. – 30 с.
2. Лилли В. Физиология грибов / В. Лилли, Г. Барнетт. – М. : Изд-во иностр. литературы, 1953. – С. 174–184.
3. Маркович H.A., Кононова Г.Л. Литические ферменты Trichoderma и их роль при защите растений от грибных болезней (обзор) // Прикл. биохим. микробиол. – 2003. – Т. 39. – № 4. – С. 389–400.
4. Марьиновская Ю.В., Севастьянова Н.Н. Микробиологическая деструкция целлюлозосодержащих отходов // Микробиология. – 2006. – № 3. – С. 75–81.
5. Феофилова Е.П. Клеточная стенка грибов. – М. : Наука, 1983. – 247 с.
6. Chet I. Innovative Approaches to Plant Disease Control / Ed. I. Chet. – N.Y. : Wiley, 1987. – P. 137–160.
7. Somogyi M.J. Notes on sugar determination // J. Biol. Chem. – 1952. – № 1. – P. 19–23.
8.  Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randell R.I. Protein measurement with Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. №1. р. 265-275.