АНТИФУНГАЛЬНАЯ И АНТИБАКТЕРИАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ БАКТЕРИЙ ШТАММОВ BACILLUS THURINGIENSIS ПРОТИВ ФИТОПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

АННОТАЦИЯ

Изучены антагонистические свойства восьми штаммов бактерий B. thuringiensis против фитопатогенных микроорганизмов. Установлено, что изученные штаммы B. thuringiensis проявили высокую антагонистическую активность против грибов A. alternatа,  V. dahliaе и бактерий B. mesentericus, P. phragmitetus, B. pumilis. Штаммы  бактерии B. thuringiensis 1, B. thuringiensis 31, B. thuringiensis 84 и B. thuringiensis 94 были отобраны в качестве эффективных штаммов в борьбе с фитопатогенными микроорганизмами.

ABSTRACT

The antagonistic properties of 8 bacteria strains of B. thuringiensis against to phytopathogenic microorganisms are studied. It has been established that the studied strains B. thuringiensis showed high antagonistic activity against to fungi A. alternatа, V. dahliaе and bacteria B. mesentericus, P. phragmitetus, B. pumilis. Bacteria strains B. thuringiensis 1, B. thuringiensis 31, B. thuringiensis 84 and B. thuringiensis 94 were selected as effective strains in the struggle against to phytopathogenic microorganisms.

Ключевые слова: антагонизм, фитопатоген, бактерия, гриб,  альтернариоз, вертициллез, скрининг, тест-культуры.

Keywords: antagonism, phytopathogen, bacteria, fungus, alternaria, verticilliosis, screening, test cultures.

Введение

Производство качественных продуктов и получение высокого урожая является одной из самых приоритетных задач устойчивого сельского хозяйства. Использование биологических методов в борьбе с болезнями, встречающимися на сельскохозяйственных культурах и связанными с ними вредителями, насекомыми и фитопатогенными микроорганизмами является наиболее безопасным и перспективным. По приблизительным подсчетам, ежегодно около трети мирового сельскохозяйственного урожая теряется из-за вредителей и фитопатогенов, несмотря на широкое потребление пестицидов, которое составляет более 2 миллионов тонн. Основной причиной этого являются экологические проблемы сельскохозяйственной системы: нарушение равновесия биоценозов, появление резистентности к пестицидам, используемым против вредителей, сорняков и др. [1].

При производстве биологических препаратов используются различные штаммы микроорганизмов. Однако, во всём мире большое внимание уделяется препаратам на основе энтомопатогенных бактерий группы B.thuringiensis, которые безопасны для человека, теплокровных животных, полезных насекомых и окружающей среды. [2]. Бактерии B.thuringiensis используются в качестве основных продуцентов при производстве энтомопатогенных препаратов против насекомых-вредителей сельского хозяйства [3,4]. Кроме этого, имеются данные, что бактерии данной группы  обладают антагонистической активностью против фитопатогенных грибов [5], бактерий [1], а также обладают  ростостимулирующими свойствами [6]. Эти бактерии  проявляют антагонизм против фитопатогенных бактерий, в частности, Erwinia carotovora [7]. Японскими учёными изучены потенциальные возможности использования бактерий  группы B.thuringiensis для контроля бактериальных заболеваний растений [8].

Полифункциональные свойства бактерий В.thuringiensis, которые защищают растения от вредителей, фитопатогенов и стимулируют их рост и развитие, представляют возможность использования этих продуцентов в производстве биопрепарата, который оказывает высокоэффективное комплексное функциональное воздействие.

Целью данного исследования является скрининг бактерий группы  B.thuringiensis, используемых в качестве продуцента при создании биопрепарата обладающего эффективным антагонистическим действием против фитопатогенных грибов и бактерий, а также инсектицидным действием против насекомых-вредителей.

Материалы и методы исследования

В качестве объекта исследования использованы 8 штаммов бактерий группы B. thuringiensis, которые ранее были выделены и хранились в коллекции лаборатории Молекулярной биологии Института микробиологии АН РУз. Ранее были изучены морфолого-культуральные и физиолого-биохимические свойства данных штаммов [9]. Культуры B.thuringiensis выращивали на питательной среде ПА (состав, г/л: пептон - 10; глюкоза -5; NaCl- 0,5;  K₂HP0₄–0,5;  MgS0₄–0.2; агар-агар – 2,0) в течение 16-17 часов при температуре 28-30°С.

Для изучения антагонистических свойств бактерий B.thuringiensis были использованы штаммы фитопатогенных грибов Verticillium dahliaе 936, Alternaria alternate 879, Aspergillus niger 982, Fusarium solani 915, которые хранятся в коллекции фитопатогенных микроорганизмов Института генетики и экспериментальной биологии АН РУз. А также, было изучено их антагонистическое отношение к бактериям Bacillus pumilis, Bacillus altitudinis, Bacillus mesentericus, Bacillus mojavensis, Paracoccus versutus, Panonibacter phragmitetus, Bacillus subtilis, выделенных из заражённых листьев растений мандарина и лимона, выращенного в условиях закрытого грунта в Ташкентской области, и идентифицированного методом масс-спектрометрии MALDI-TOF. Данные бактерии были условно пронумерованы порядковыми номерами от 1 до 7.

Фитопатогенные грибы выращивали на питательной среде Чапека в течение 6 суток при температуре 28-30°С. Бактерии, использованные в качестве тест-культуры культивировали 3 суток на мясо-пептонном агаре при температуре 28-30°С.

Для определения антагонистической активности штаммы бактерий группы  B.thuringiensis культивировали на ПА. В чашки Петри с питательной средой методом газона с помощью стекляного шпателя вносились фитопатогенные грибы (10⁶ спор/мл) и бактерии (10¹¹-10¹² спора/мл) в объёме 0,1 мл. Затем, из образцов штаммов бактерии B.thuringiensis, выращенных на питательной среде ПА в течение 16-17 часов, были нарезаны блоки по 0,8 см и размещены на поверхность питательной среды с фитопатогенами. Образцы инкубировались в течение 5 суток при температуре 28-30°С.

Антагонистическую  активность культур по отношению к фитопатогенам  (грибы: Verticillium dahliaе  936, Alternaria alternatа 879, Aspergillus niger 982, Fusarium solani 915; бактерии Bacillus pumilis, Bacillus altitudinis, Bacillus mesentericus, Bacillus mojavensis, Paracoccus versutus, Panonibacter phragmitetus, Bacillus subtilis) определяли методом агаровых блоков [10]. Для этого поверхность питательного агара, пригодного для развития исследуемого антагониста и образования антибиотических веществ, засевали сплошным газоном патогена. Посевы инкубировали в термостате при 28-30 ⁰С. Стерильным пробочным сверлом вырезали агаровые блоки и переносили в чашки Петри, предварительно засеянные патогенами.  Наблюдения вели каждый день в течение дней. Cтепень антагонистической активности оценивали по зонам подавления роста патогена вокруг агаровых блоков с исследуемым объектом. Эксперимент проводили в 3-х кратной повторности.

Результаты исследования

Как показали результаты проведённых исследований, штаммы бактерий B.thuringiensis обладают антагонистической активностью по отношению к штаммам грибов V. dahliaе 936 и A. alternatа 879. Зона подавления фитопатогенных грибов A. alternatа 879 штаммами  B. thuringiensis 1 и B. thuringiensis 94 составляет 28-30 мм и 20-22 мм. Также данные культуры активно подавляют рост и развитие V. dahliaе 936, у которых зоны подавления гриба составляли  20-23 мм и 20-22 мм (рисунок 1, таблица 1). Кроме этого, антагонистическую активность против гриба V. dahlia 936 показали штаммы B. thuringiensis 84, B. thuringiensis 91 и B. thuringiensis 93, зоны подавления роста гриба составляли 18-22 мм, 18-22 мм и 18-20 мм, соответственно. Штамм обладающий энтомопатогенной активностью  B. thuringiensis 26 образовывает лизисную зону 16-20 мм по отношению к фитопатогенному грибу A. alternatа 879. Однако, у данного штамма выявлено отсутствие антагонистической активности по отношению к фитопатогенным грибам V. dahliaе 936, A. niger 982 и F. solani 915 (таблица 1).

Таблица 1.

Антагонистическая активность штаммов бактерии B.thuringiensis против фитопатогенных грибов, мм

Рисунок 1. Антагонистическая активность штаммов бактерий группы  B.thuringiensis против фитопатогенных грибов

При изучении антагонистической активности штаммов бактерий группы  B.thuringiensis к фитопатогенным бактериям, выделенным из заражённых листьев лимона и мандарина, выявлено проявление антагонистической активности против бактерий B.mesentericus 3,  P.phragmitetus 6,  B.subtilis 7 и B. pumilis 1. По отношению к B.mesentericus 3 штаммы B. thuringiensis 84 и 31 проявили самую эффективную антагонистическую активность (25-30 мм и 22-25 мм, соответственно). Выявлено, что B. thuringiensis 94 и B. thuringiensis 26 имеют антагонистическую активность против P.phragmitetus 6 и  зоны подавления роста и развития бактерий составляет  в 20-23 мм и 20-22 мм. Следует отметить, что  штамм B.thuringiensis 1 проявляет антагонистическую активность против B. pumilis 1 (14-16 мм) и B. mesentericus 3 (15-17 мм). Штамм B.thuringiensis 93 образовал антагонистическую зону 17-19 мм по отношению к штамму бактерии P. phragmitetus 6, а штамм B. subtilis 7 проявил наиболее высокую антагонистическую активность (16-21 мм) (рис.2, табл.2). Изученные штаммы B.thuringiensis не проявляли антагонистичсекую активность  по отношению к B.altitudinis 2, B. mojavensis 4 и P. versutus 5 (табл. 2). Следует отметить, что штамм B.thuringiensis 18 не показал антагонистическую активность по отношению ко всем  испытанным фитопатогенным грибам и  бактериям использованным в экспериментах.

Таблица 2.

Антагонистическая активность штаммов бактерии B.thuringiensis по отношению к бактериям (мм)

Рисунок 2. Антагонистическая активность штаммов  бактерий группы  B.thuringiensis по отношению к бактериям, выделенным из заражённых листьев лимона и мандарина

Согласно литературным данным,  бактерии Bacillus mesentericus являются фитопатогеном, заражающим лён, кукурузу, свёклу, плоды апельсина и других растений [11]. Panonibacter phragmitetus – является биологической вредной инфекцией при выращивании микроводорослей и цианобактерий в крупных масштабах в открытых водных бассейнах и нестерильных условиях, а также основной опасностью при производстве этанола фотосинтетическим методом в данных условиях [12]. Bacillus pumilis является новой выявленной фитопатогенной бактерией, и при искуственном заражении сосны обыкновенной (Pínus sylvéstris L) клетками Bacillus pumilis Р10 выявлено проявление признаков заболевания [13]. До недавнего времени данная бактерия считалась обычным представителем нормальной эпифитной микрофлоры растений. Они даже использовались против возбудителей бактериоза в качестве антагониста [14]. В настоящее время выявлены случаи заболевания зелёных органов картофеля, фасоли, персика и манго, вызванные этими бактериями [15, 16, 17].

Таким образом, штаммы бактерии B.thuringiensis обладают высокой антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным грибам V. dahliaе 936 и A. alternatа 879, и бактерий Bacillus mesentericus, Panonibacter phragmitetus, Bacillus pumilis.

Выводы

Согласно результатам проведённых исследований, штаммы бактерии B.thuringiensis обладают высокой антагонистической активностью по отношению к A. alternatа и V. dahliaе, являющимися возбудителями заболевания альтернариозного и вертициллёзного увядания, и наносящих большой ущерб сельскохозяйственным растениям. Штаммы B.thuringiensis 1, B.thuringiensis 31 и B.thuringiensis 94 обладают высокой антагонистической активностью по отношению к этим фитопатогенным грибам.

Выявлена антагонистическая активность штаммов бактерии B.thuringiensis по отношению к бактериям Bacillus mesentericus, Panonibacter phragmitetus, Bacillus pumilis, выделенным из листьев лимона и мандарина и являющихся возбудителями заболеваний  растений. Штаммы B. thuringiensis 84, B. thuringiensis 31 ва B. thuringiensis 94 проявили высокую антагонистическую активность по отношению к вышеуказанным фитопатогенным бактериям.

Согласно результатам проведённого скрининга, эффективные штаммы B. thuringiensis 1, B. thuringiensis 31, B. thuringiensis 84 ва B. thuringiensis 94, могут быть использованы в качестве перспективных источников при создании биопрепаратов.

Список литературы:

1. Калмыкова Г.В., Горобей И.М., Осипова Г.М. Перспективы использования Bacillus thuringiensis как биологического агента защиты растений // Биотехнология №4, 2016. -С. 12-19.
2. Гришечкина С.Д., Ермолова В.П. Эффективность бацикола на основе нового штамма Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis № 25 против вредителей-фитофагов и фитопатогенов // Сельскохозяйственная биология, 2015, том 50, № 3, с. 361-368.
3. Кандыбин Н.В., Патыка Т.И., Ермолова В.П., Патыка В.Ф. Микробиоконтроль численности насекомых и его доминанта Bacillus thuringiensis. СПб—Пушкин, 2009.
4. К а н д ы б и н Н.В., Смирнов О.В., Барбашова Н.М. Новый энтомоцидный препарат со специфическим действием на жесткокрылых. Мат. Всерос. науч.-произв. совещания (Краснодар, 1994). Пущино, 1994, ч. 2: 179-181.
5. Гришечкина С.Д., Смирнов О.В., Кандыбин Н.В. Фунгистатическая активность различных подвидов Bacillus thuringiensis. Микология и фитопатология, 2002, 36(1): 58-62.
6. Korobov Ya.A., Kamenek L.K., Kamenek V.M., Useeva L.F. Rostostimuliruyushchee deistvie del’ta-endotoksina Bacillus thuringiensis na yuvenil’nye rasteniya pshenitsy [The growthpromoting effect of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin on juvenile wheat plants]. Ul’yanovskii mediko-biologicheskii zhurnal [Ulyanovsk Biomedical Journal], 2017, no. 2, pp.152–158. (In Russian).
7. Азизбекнян Р.Р., Кузин А.И., Кузнецова Н.И., Григорьева Т.М., Николаенко М.А., Зубашева М.В. Штамм бактерий Bacillus thuringiensis, проявляющий фунгицидную активность, инсектицидную активность и подавляющий вирулентные свойства фитопатогенных бактерий Erwinia carotovora // Патент России №2347809 по кл. С12N 1/20, A01N 63/00, опуб. 27.02.2009.
8. Elsharkawy M.M., Nakatani M., Nishimura M., Arakawa T, Shimizu M. Control of tomato bacterial and root-knot diseases by Bacillus thuringiensis CR-371 and Streptomyces avermectinius NBRC14893. Soil Plant Sci. 2015, vol. 65, pp. 575–580. DOI:10.1080/09064710 .2015.1031819. (In Russian).
9. Khalilov I.M., Kadirova G. Kh., Shakirov Z.S.Selection of nutrient media for the cultivation of bacterial strains of Bacillus thuringiensis against caterpillars of gypsy moth (Lymantria dispar)// European Sciences review. 2018. № 11–12. Volume 2, P.41-45.
10. Гусев М. В., Минеева Л. А. Микробиология. Учеб. Пособие для ВУЗов. -  М.: Академия, 2006.- 460 с.
11. Калдыркаева З.С., Золотухин С.Н. Распространение бактерий рода Васillus в пищевых продуктах // Первые шаги в науке, -с. 184-187.
12. Zhi Zhu, Guodong Luan, Xiaoming Tan, Haocui Zhang, Xuefeng Lu / Rescuing ethanol photosynthetic production of cyanobacteria in non-sterilized outdoor cultivations with a bicarbonate-based pH-rising strategy // Biotechnol Biofuels (2017) 10:93. 11 p. DOI 10.1186/s13068-017-0765-5.
13. Ю.Н. Горовик, Ю.И. Шаловило, В.А. Ковалева, А.Л. Лагоненко, Р.Т. Гут, А.Н. Евтушенков / Bacillus pumilis – Новый фитопатоген сосны обыкновенной // Труды БГУ 2012, том 7, часть 1–2. -С. 194-198.
14. Choudhary, D.K. Interactions of Bacillus spp. and plants – With special reference to induced systemic resistance (ISR) / D.K. Choudhary, B.N. Johri // Microbiological Research. – 2009. – Vol. 164, № 5. – P. 493–513.
15. Galal, A. Bacillus pumilus, A New Pathogen on Mango Plants / A. Galal, A. El-Bana, J. Janse // Egyptian Journal of Phytopathology. – 2006. – Vol. 34, № 1. – P. 17–29.
16. First report of Bacillus pumilus on Phaseolus vulgaris in Spain / M.I. Font [et al.] // New disease reports. – 2009. – Vol. 19. – P. 54.
17. Saleh, O.I. Bacillus pumilus, the cause of bacterial blotch of immature balady peach in Egypt / O.I. Saleh, P.Y. Huang, J.S. Huang // Journal of Phytopathology. – 1997. – Vol. 145. – P. 447–453.