РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ М-КРЕЗОЛА В ЛЕКАРСТВЕННОМ ПРЕПАРАТЕ РАСТВОРЕННОГО ИНЪЕКЦИОННОГО ИНСУЛИНА

АННОТАЦИЯ

В статье приводятся результаты исследований по разработке методики определения метакрезола в лекарственном препарате растворенного инъекционного инсулина. Выбраны реагенты для реакции комплексообразования ионов железа (III) с м-крезолом; определены λ_макс. оптического поглощения комплекса реагента (FeCl₃) c м-крезолом и влияние рН на аналитический сигнал. Линейность градуировочного графика зависимости оптической плотности от концентрации м-крезола наблюдается в диапазоне 0,625 -12,5 мг в 8 мл раствора при λ_макс. =567 нм, коэффициент корреляции R² 0,981.

ABSTRACT

This article presents the results of the development of a methodic for the determination of metacresol in a medicinal product of dissolved injectable insulin. The choice of the reagent for the complexation reaction, finding the λ maximum of the complex of the reagent (FeCl3) with m-cresol, the effect of pH on the analytical signal was studied. The straightness of the optical density in the determination of m-cresol in the concentration range of 0.625–12.5 mg / 8 ml with a correlation coefficient (R2) of 0.981 at λ max 567 nm has been proved.

Ключевые слова: м-крезол, инсулин, консерванты инсулина, сорбционная спектроскопия.

Keywords: m-cresol, insulin, insulin preservatives, sorption spectroscopy.

Инсулин производится поджелудочной железой и регулируется в зависимости от уровня сахара в крови и других гормонов в организме. У здорового человека производство и высвобождение инсулина - это строго регулируемый процесс, позволяющий организму сбалансировать свои метаболические потребности [1].

Суточные колебания уровня глюкозы в крови контролируются путем введения комбинации инсулинов быстрого и пролонгированного действия. Инсулин быстрого действия (растворенный) обеспечивает высокую дозу инсулина во время еды, в то время как инсулин пролонгированного (нерастворённый) действия обеспечивает преобладающий базальный уровень инсулина между приемами пищи, особенно в течение ночи [2].

М-крезол используется как бактерицид при биотехнологической переработке фармацевтических препаратов; консервант в фармацевтических препаратах [инъекционные растворы инсулина], пестицид для обработки стеблей плодовых деревьев и растений. Воздействие на людей возможно при использовании м-крезола в качестве консерванта в фармацевтических растворах для инъекций.

м-Крезол, обычно используемый как бактерицидный препарат в агро- и биотехнологиях, зачастую применяется в качестве консерванта в фармакологических препаратах, в частности в растворах инсулина для инъекций.  Это может оказывать отрицательное воздействие на организм человека.

Смесь м-крезола, п-крезола и м/п-крезола всасываются через дыхательные и желудочно-кишечные тракты, а также через кожу и распределяются по всему телу. Первичный путь метаболизма всех изомеров крезола - конъюгация с глюкуроновой кислотой и неорганическими сульфатами. Все изомеры, в основном, выводятся почками в виде вышеупомянутых конъюгированных форм. Оральная LD₅₀ неразбавленного м-крезола у крыс составляла 242 мг/кг массы тела. Клинические признаки включают гипоактивность, слюноотделение, тремор и судороги. Смертности, клинических признаков токсичности не наблюдалось после воздействия концентрации насыщенных паров м-крезола или п-крезола. Однако вдыхание аэрозолей может привести к смерти.  Так, сообщалось, что средние летальные концентрации п-крезола у крыс составили 29 мг/м³ и 58 мг/м³ для м-крезола. [3]

Разработаны различные методики определения м-крезола в песке [4], сточных водах [5-6], в инсулине [3] и пр. c помощью газовой, жидкостной хроматографий, электрохимическими, спектроскопическими [7] и другими методами.

Экспериментальная часть

Реагенты и аппаратура. Исходные растворы реагента FeCl₃ и Fe₂(SO₄)₃ «х.ч.» готовили растворением точной навески, предварительно растворяя в концентрированной соляной кислоте и доводя до метки ультрачистой водой (УЧВ), необходимую концентрацию получали разбавлением исходного раствора. Концентрацию растворов устанавливали комплексонометрически по методике [8]. Стандартные растворы м-крезола готовили по стандартной методике. Навеску 1,08 мг м-крезола растворяли в 0,01 М HCl кислоты в 1 л мерной колбе, емкостью 1 л.

Навески взвешивали на микровесы Sartorius серии Cubis MSA66S с максимальной нагрузкой до 61 г и дискретностью 0,001 мг аналитических весах Sartorius MSA66S максимальное количество навески 61 г.  (Германия).

pH растворов измеряли на рН-метре SevenExcellencepH/mV/TEMP Mettler Toledo (Германия). Спектры поглощения измеряли на двухлучевом спектрофотометре UV-1800 Shimadzu (Япония), кюветы 10 мм кварцевые. УЧВ для приготовления растворов получали с использованием прибора HealForceWaterPurificationSystemSmart-N (Китай).

Оптическую плотность растворов до и после сорбции на носителе измеряли на UV-1800, рH растворов измеряли на рН-метре SevenExcellencepH/mV/TEMP MettlerToledo.

Методика проведения исследования. Приготовленные растворы реагента FeCl₃, Fe₂(SO₄)₃, м-крезола хранились при температуре 2-8^оС. Заранее экспериментальным путём была установлена оптимальная концентрация реагента, которая позволяет визуализировать спектры поглощения. Оптимальный UV-Vis-спектр получен при разбавлении исходного раствора реагента УЧВ до 1,254 мг/мл. К отдельно взятым 2 мл раствора реагента (Re) добавляли от 0,1 до 6 мл раствора м-крезола и доводили общий объем до 8 мл УЧВ. После тщательного перемешивания (2 мин), измерялись спектры поглощения в диапазоне 190-1100 нм для определения λ макс. Измерения проводили относительно УЧВ. Для точности измерения установлены следующие параметры скорость измерения «Medium» (среднее) и «SamplingInterval» (интервал измерения) 1,0 нм. Приведенные параметры устанавливали экспериментально для выявления более презентабельных и точных результатов.

Результаты и их обсуждение

Оптимизация условий комплексообразования проводилась определением максимального аналитического сигнала при варьировании концентрации м-крезола и реагента в растворе. Аналитическим сигналом служила интенсивность поглощения цвета в УФ- и видимых диапазонах.

Рисунок 1. Спектр поглощения комплекса реагента Re-1 с м-крезолом

Линейность зависимости оптической плотности от концентрации полученного комплекса проверяли путем приготовления нескольких образцов из исходного раствора м-крезола в диапазоне 0,625–12,5 мг /8 мл, после чего, абсорбция была измерена при этих концентрациях. По полученным данным  строили калибровочную кривую зависимости оптической плотности от концентрации полученного комплекса (Табл. 1.).

Таблица 1.

Исследования линейности для различных концентраций м-крезола

Интерпретация данных таблицы 1 представлена на рисунке 2.

Рисунок 2. Калибровочная кривая м-крезола

Коэффициент корреляции (R²) составил 0,981 в диапазоне концентраций 0,625–12,5 мг /8 мл.

Выводы

Исследовано комплексообразование м-крезола с солями железа (III). Установлено оптимальное соотношение реагентов и снят УФ-спектр в диапазоне 200-1100нм. Максимальное поглощение наблюдается в видимом диапазоне при λ max =567 нм. Изучено влияние рН на величину оптического поглощения. Разработана простая методика определения м-крезола в препаратах растворенного инсулина. Линейность калибровочного графика наблюдается в диапазоне 0,925 – 12,5 мг м-крезола в 8 мл водного раствора. Коэффициент корреляции R2 составил 0,981, что свидетельствует о приемлемой с метрологической точки зрения, точности анализа.

Разрабатываемая методика может быть предложена как чувствительный метод после оптимизации некоторых параметров и изучения влияний мешающих компонентов для определения м-крезола в фармацевтике.

Список литературы:

1. Hormonehealth: WhatisInsulin [Электронный ресурс]. - Режим доступа: URL:https://www.hormone.org/your-health-and-hormones/glands-and-hormones-a-to-z/hormones/insulin (дата обращения: 30.09.2021).
2. Whittingham J.L., Edwards D.J., Antson A.A., Clarkson J.V., Dodson G.G. Interactions of Phenol and m-Cresol in the Insulin Hexamer, and Their Effect on the Association Properties of B28 Pro f Asp Insulin Analogues // Biochemistry –1998. –37. –P 11516–11523
3. Rane SS, Ajameri A, Mody R, Padmaja P. Validation of a simple RP-HPLC method developed for the quantification of meta-cresol in parathyroid hormones formulation // Pharm Methods. – 2011 Jul.  – 2(3). – P 203– 8. [Электронный ресурс]. - Режимдоступа: URL: doi: 10.4103/2229-4708.90366.(дата обращения: 30.09.2021).
4. Russel M., Zhenxiang S., Changrui L., Hao Z., Lifen L., Marios S., Yong Z. Development of a detection method based on dielectric spectroscopy for real-time monitoring of meta-cresol contamination in beach-sand // Sensors and Actuators A. – 2017. – V 268. – P 16–26 [Электронный ресурс]. – Режим доступа: URL: https://doi.org/10.1016/j.sna.2017.10.049 (дата обращения: 30.09.2021).
5. Kamel R.M., Shahat A., Anwar Z.M., El-Kady H.A., Kilany E.M. Efficient dual sensor of alternate nanomaterials for sensitive and rapid monitoring of ultra-trace phenols in sea water // Journal of Molecular Liquids. –V 297, –2020. –111798, [Электронный ресурс]. – Режим доступа: URL: https://doi.org/10.1016/j.molliq.2019.111798. (дата обращения: 30.09.2021).
6. Zhao L., Lee H.K. Determination of Phenols in Water Using Liquid Phase Microextraction with Back Extraction Combined with High-Performance Liquid Chromatography. // Journal of Chromatography.2001. –Vol.931. – No.1-2. –Р. 95–105. [Электронный ресурс]. URL:https://doi.org/10.1016/S0021-9673(01)01199-2(дата обращения: 27.03.2021)
7. Fiamegos Y.C., Stalikas C.D., Pilidis G.A., Karayannis M.I. Synthesis and Analytical Applications of 4-Aminopyrazolone Derivatives as Chromogenic Agents for the Spectrophotometric Determination of Phenols. //Analytica Chimica Acta, 2000. –Vol. 403. – No 1-2. – Р. 315–323. [Электронныйресурс].URL:https://doi.org/10.1016/S0003-2670(99)00644-3(дата обращения: 27.03.2021)
8. Булатов М.И., Калинкин И.П. Практическое руководство по фотометрическим методам анализа. – Ленинград: Химия, 1986. –  С.62-63.