ИЗУЧЕНИЕ СТЕПЕНИ СВЯЗЫВАНИЯ РАДИОНУКЛИДА ЙОД-125 С РАЗЛИЧНЫМИ БИОЛОГИЧЕСКИМИ МАКРОМОЛЕКУЛАМИ

АННОТАЦИЯ

Статья посвящена исследованию степени связывания радионуклида йод-125 без носителя с биологическими макромолекулами методом жидкостного электрофореза и гамма-радиометрии. В качестве носителя использована смесь йодида, йодата и гидрокарбоната натрия, а в качестве электролита фосфатный буферный раствор с рН 7,0 ± 0,2. Показано, что степень связывания йод-125 с макромолекулами использованных в экспериментах составила более 90 %.

ABSTRACT

The article is devoted to the study of the degree of binding of the iodine-125 radionuclide without a carrier to biological macromolecules by liquid electrophoresis and gamma radiometry. A mixture of iodide, iodate and sodium bicarbonate was used as a carrier, and a phosphate buffer solution with a pH of 7.0 ± 0.2 was used as an electrolyte. It was shown that the degree of binding of iodine-125 with macromolecules used in the experiments was more than 90%.

Ключевые слова: макромолекула, гамма-радиометр, лактопероксидаза

адренокортикотропин гипоталамуса, реактив Болтон-Хантера, буферный раствор.

Keywords: macromolecule, gamma radiometer, lactoperoxidase adrenocorticotroping, hypothalamus, Bolton-Hunter reagent, buffer solution.

Введение

Соединения, меченные радиоизотопами йода, являются тонким инструментом исследований в различных областях ядерной медицины, а также в диагностике и лечении при различных онкологических заболеваниях.

Среди радиоактивных изотопов йода самым популярным для исследовательских работ в науке и медицине является йод-125. Это связано с тем, что йод-125 имеет удобный для исследований период полураспада и энергию ядерного излучения. Исследования с йодом-125, в основном, проводятся в присутствии белков и пептидов, которые широко используются для иммунологических, рецепторных, гормональных и др. исследований. При йодировании белка его физико-химические и био-физиологические свойства практически не меняются, что очень важно для последующего использования меченого препарата.

Использование ¹²⁵I в радиоиммунном анализе и радиорецепторном тестировании позволяет определить количество вещества не только в плазме или сыворотке крови, но и в любой биологической жидкости, выяснить его физиологические свойства, его иммунореактивность и биологическую активность. Как химическая модификация, радиойодирование используется для исследования локализации тирозиновых и гистидиновых остатков в белковой макромолекуле, их участия в функционировании белка, при проведении фармакокинетических исследований, для оценки скорости выведения из организма различных антибиотиков, соматотропных, психотропных и других лекарственных препаратов. Достоверность получаемой информации в существенной степени зависит от качества используемого радиолиганда [1]. Радиойодирование белков, нуклеиновых кислот и их компонентов широко применяется при изучении их метаболизма, рецепции, локализации в надмолекулярных структурах, для радиотестирования in vitro и in vivo в медицине [2-4].

В настоящей работе приведены результаты экспериментов по исследованию степени связывания радионуклида йода-125 без носителя с различными биологическими макромолекулами методом жидкостного электрофореза.

Экспериментальная часть

Связывание радионуклида йода-125 с биологическими макромолекулами определяли методом жидкостного электрофореза. В качестве носителя использовали смесь йодида, йодата и гидрокарбоната натрия, а в качестве электролита фосфатный буферный раствор с рН 7,0 ± 0,2. Измерение распределения активности ¹²⁵I по длине хроматографической полоски проводили с использованием четырехканального γ-радиометрического устройства NP-424L.

Реактивы: хлорамин-Т, адренокортикотропин гипоталамуса (АКТГ), реактив Болтона-Хантера (БХ), лактопероксидазa (ЛП)- (SigmaAldrich (США)), гидрокарбонат натрия (NaHCO₃), йодат калия (KIO₃), йодид калия (KI), калий фосфорнокислый однозамещенный (KH₂PO₄), натрий фосфорнокислый двузамещенный безводный (Na₂HPO₄) – квалификации «хч».

Методика эксперимента: для определения связывания радионуклида йод-125 с биологическими макромолекулами в три конические пробирки Эппендорфа (объем 0,5 мл) вносили по 5 мК и субстанции йодида натрия, меченого йодом-125. В первую и вторую пробирку вносили по 10 мкл раствора  хлорамина-Т, а в третью пробирку 15 мкл раствора ЛП (2 мг/мл) и хорошо перемешивали. Через 2-3 мин в первую пробирку добавили 15 мкл раствора АКТГ (2 мг/мл), во вторую пробирку 20 мкл реактива БХ (2 мг/мл) и в третью пробирку 15 мкл раствора АКТГ (2 мг/мл) и вновь тщательно перемешивали.

Реакционную смесь помещали в термостат с температурой 37ºС на 15 мин. Затем в каждую реакционную смесь добавляли 250 мкл дистиллированной воды.

Полоски хроматографической бумаги готовили следующим образом. Бумагу марки «С» разрезали на полоски размером 15 х 250 мм. Отступив от одного края на 50 мм (стартовая линия), наносили10-20 мкл раствора носителя (состав носителя - 100 мг йодида калия, 200 мг йодат калия и 1г бикарбоната натрия в 100 мл бидистиллированной воде). После высушивания раствора на воздухе, на то же место наносили 1 мкл раствора макромолекулы, меченой  ¹²⁵I (активность 0,96 МБк).

Полоску увлажняли фосфатным буферным раствором с рН 7,0 + 0,2 и помещали в камеру прибора для электрофореза так, чтобы линия старта располагалась со стороны катода. Разделение проводили в течение 50 мин в охлажденной камере при градиенте потенциала 16 В/см. В качестве электролита использовали фосфатный буферный раствор с рН 7,0 + 0,2.

Полученную электрофореграмму высушивали при комнатной температуре, обклеивали с двух сторон полиэтиленовой пленкой с липким слоем (ГОСТ 20477-86) и измеряли скорость счета отдельных участков электрофореграммы шириной по 1 см, начиная от линии старта к финишу радиометрическим методом.

По проявленной электрофореграмме определяли степень связывания¹²⁵I в макромолекулу измерением с помощью γ-радиометрического устройства в течение 10 с. Доля макромолекулы, меченого йодом-125 в реакционной смеси должна быть не менее 85,0 % от общей радиоактивности, а значение Rf в пределах 0,0-0,4, в то время как значение Rf не связанных ионов йода-125 в пределах 0,9±0,02. Перед измерениями гамма активности измеряли фон, 3 раза по 10 с. Результат усредняли.

По соотношению площадей пиков, соответствующих основной ¹²⁵I-макромолекуле и примесным формам йода-125 ионов вычисляли степень связывания:

где:

Σ_пик – сумма импульсов ¹²⁵I-макромолекулы в пике;

Σ_общ – общая сумма импульсов;

D_св – степень связывания.

Результаты измерений приведены в таблице 1 и рисунке 1.

Таблица 1.

Результаты измерений мечения радионуклида йода-125, без носителя с различными биологическими макромолекулами

Рисунок 1. Гистограмма распределения ¹²⁵I-макромолекула по длине электрофореграммы

Заключение

Методом жидкостного электрофореза и гамма-радиометрии исследована степень связывания радионуклида йод-125 при мечении им различных макромолекул белков и пептидов. Экспериментально установлено, что степень связывания йода-125 со всеми тремя исследованными макромолекулами составляет более 90%.

Список литературы:

1. Макаренко М.В., Усанов С.А. Синтез и тестирование[¹²⁵I]-маркеров для аналитических целей: Проблемы и новые подходы // Институт биоорганической химии НАНБ. Минск, 2006.№1.-C. 268-279.
2. Миролюбова О.Ю., Макаренко М.В., Климович В.Б., и др. Распределение [¹²⁵I]-моноклональных антител к белкам Бенс-Джонса в организме животных// Мед. радиология.-1990. Т. 35, №6.- С. 25-27.
3. Макаренко  М.В.Ферментативный  способ  получения[125I]-меченных белковых антигенов и моноклональных антител// Вести НАН Беларуси. Сер. хим. н.-1992. №5-6.-С. 79-84.
4. Дрожденюк А.П., Макаренко М.В., Сенчук Ю.В.,  Усанов  С.А.,  Мороз  И.Н.  Специфическое микроопределение ретинол-связывающего  белка  человека  в  биологических  жидкостях // VI Менделеевский съезд общей прикладной химии. Москва, 1998.-С. 44-45.