ИЗУЧЕНИЕ ЦЕЛЛЮЛАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ТЕРМИТОВ ПО ДЕГРАДАЦИИ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ

АННОТАЦИЯ

Термиты играют важную роль в деградации целлюлозных материалов в природе, и особое внимание уделяется активности и экспрессии термитных целлюлаз. Целью научного исследования является изучение целлюлатической ферментной активности термитов. При этом изучали активность ферментов с разных частей тела термитов.

ABSTRACT

Termites play an important role in the degradation of cellulose materials in nature, and special attention is paid to the activity and expression of termite cellulases. The purpose of the research is to study the cellulatic enzyme activity of termites. At the same time, the activity of enzymes from different parts of the body of termites was studied.

Ключевые слова: термит, целлюлаза, целлюлоза, эндо-α-1,4- глюканазы, целлобиогидролазы, β-глюкозидазы.

Keywords: termite, cellulase, cellulose, endo-α-1,4-glucanases, cellobiohydrolases, β-glucosidases.

Термиты наносят серьезный вред деревянным конструкциям культурно-исторических памятников, объектам стратегического назначения, гидротехническим сооружениям, населенным пунктам и административным зданиям. Одна семья термитов из 25 тысяч особей, обитающая в 100 см³ объема, в год потребляет в среднем до 50 тысяч см³ различного вида целлюлозы. Вместе с тем все это приводит к глобальному круговороту углерода и повышению в атмосфере концентрации парникового газа – диоксида углерода. Все это осуществляется за счет пищеварительных секретов термитов и ферментов симбионтов, а также за счет активности биохимических процессов.

Скрытый образ жизни термитов, сильная защита от экологических факторов окружающей среды, функциональная специализация каст в термитнике и способность в краткие сроки восстанавливать свою популяцию затрудняют применение средств борьбы с ними. Исходя из этого, определение популяционной экологии термитов и взаимоотношений с позвоночными/беспозвоночными и микроорганизмами, а также разработка современных биологических методов борьбы, контролирующих численность термитов, имеют актуальное значение.

Следует отметить недостаточность научных исследований для защиты населенных пунктов и других сооружений от вреда термитов, причин переселения и распространения термитов из природных условий в урбанизированные экосистемы. В настоящее время весьма актуальными проблемами являются определение распространения популяции термитов, а также физиолого-биохимических процессов, связанных с пищеварительными секретами и активностью ферментов симбионтов, выявление новых видов микроорганизмов-паразитов термитов, совершенствование методов борьбы, основанных на создании ядовитых приманок на основе патогенов-грибов и микроорганизмов.

Термиты имеют специализированную систему переваривания целлюлозы [1]. Различные целлюлазы участвуют в деградации целлюлозы у термитов и их симбионтов. Важным направлением исследований является изучение целлюлазной активности термитов. Три основных типа целлюлаз – это эндо-α-1,4- глюканазы, целлобиогидролазы и β-глюкозидазы, и деградация целлюлозы требует синергического действия трех типов гликозидгидролаз. Модели и характеры целлюлаз у термитов и их симбионтов были широко описаны [6], а целлюлазная активность целлюлаз и их распределение в пищеварительной системе были различными у различных видов термитов. В последнее время в основном изучались распределения различной активности целлюлазы в каждом сегменте кишечника термитов, и обнаружили, что экспрессия генов эндогенной целлюлазы переместилась из слюнных желез низших термитов в среднюю кишку высших термитов.

Последние исследования показывают, что распределение целлюлазной активности у термитов связано с их эволюционными уровнями [5; 3].

Материалы и методы. Термиты. В Узбекистане встречаются представители термитов рода Anacanthotermes turkestanicus, Anacanthotermes ahngerianus. Нашим объектом исследований являются термиты рода Anacanthotermes turkestanicus. Термиты были привезены из разных областей Узбекистана.

Получение сырого фермента. Для получения ферментных экстрактов рабочих или солдат промывали предварительно охлажденным 0,09%-ным нормальным физиологическим раствором. 1-й образец – пятнадцать комплектов головок (включая слюнные железы), 2-й образец – грудной и брюшной отделы тела термита, 3-й образец – целое тело термитов. Все образцы собирали в пробирки и гомогенизировали в 500 мл 0,1 М ацетатно-натриевого буфера (САБ) (рН = 5,6) на льду. Пробирки центрифугировали при 12000 об/мин в течение 15 мин при температуре 4 °С, а супернатанты доводили до объема 500 добавлением 0,1 М САБ и использовали в качестве ферментного экстракта. В качестве контроля использовали тот же объем 0,1 М САБ.

Анализ активности целлюлазы. В двух пробирках суспензировали по 50 мг окрашенного субстрата в 4 мл 0,1 М ацетатного буфера (pH = 4,5) при 40 °С, перемешивая на магнитной мешалке 5 мин. Затем в одну пробирку добавляли 0,1 мл раствора, содержащего 2–6 мг ферментного препарата, продолжая перемешивать. В другую пробирку также добавляли 0,1 мл указанного раствора ферментного препарата, и содержимое быстро пропускали через фильтр (контроль). Через 20 мин реакционную смесь в первой пробирке пропускали через фильтр и определяли оптическую плотность фильтрата при длине волны 490 нм для ОЦ-31 и 375 нм для НОЦ-ОХ против контрольной пробы.

Оптическую плотность гидролизатов измеряли на спектрофотометре Spekol-II (ГДР). Целлюлазную активность определяли по результатам трех параллельных измерений согласно формуле:

А (усл. ед./г) =  ,

где Д – оптическая плотность гидролизата;

М – масса ферментного препарата, взятого для анализа.

За условную единицу активности принимали активность такого количества фермента, которое образует 1 ед. оптической плотности при 500, 490, 410 или 375 нм (в зависимости от типа красителя) за 20 мин.

Таблица 1.

Полная целлюлазная активность разных частей тела у испытуемых рабочих-термитов

Фильтровальная бумага, градуировочная активность. Мы провели сравнительное определение активности из трех отделов тела термитов сырых ферментов по отношению к фильтровальной бумаге, которую определяли по образованию глюкозы и восстанавливающих сахаров методом Шомоди – Нельсона [4]. За единицу активности принимали количество фермента, которое приводит к образованию 1 мкМ ВС за 1 мин из соответствующего субстрата. На таблице 1 и рисунке 1 представлены результаты этих экспериментов, из которых видно, что наиболее активными оказались образцы грудно-брюшной части тела термитов.

Для подбора оптимальных параметров гидролиза были проведены эксперименты по гидролизу при рН 5,0 среды и температуре 55–60 °С. Начальная скорость ферментативного гидролиза существенно зависит от степени адсорбции ферментов на субстрате. В ряде случаев начальную скорость реакции можно увеличить, добавляя поверхностно-активные вещества (ПАВ), которые увеличивают смачиваемость целлюлозы, а соответственно, и биодоступность ее для ферментов. Мы провели исследование начальной скорости ферментативной реакции по выходу глюкозы при добавлении различных концентраций ПАВ Тритона Х-100. Наиболее эффективно увеличивает начальную скорость ферментативного гидролиза 0,5%-ный Тритон Х-100. Более высокие концентрации Тритона Х-100 эффекта не дают.

Во втором этапе наших исследований было запланировано решать задачи, в которые входило приготовление суспензий головного, грудно-брюшного отделов и целого тела термитов, в данном разделе были определены биодеградуемость фильтровальной бумаги при действии суспензии, полученной из разных частей тела термитов. Оптимальное соотношение: не фильтровальная суспензия – 1, 2, 3; фильтровальная (центрифугированная) суспензия – 4, 5, 6 и 7 чистый ферментный препарат (контроль).

Рисунок 1. Выход глюкозы (г/л) при ферментативном гидролизе фильтровальной бумаги с помощью различных суспензий, полученных из разных частей тела термитов: образец I, образец II, образец III.

1 – не фильтровальная суспензия целого тела термитов; 2 – не фильтровальная суспензия головного отдела термитов; 3 – не фильтровальная суспензия грудно-брюшного отдела термитов; 4 – фильтровальная (центрифугированная) суспензия целого тела термитов; 5 – фильтровальная (центрифугированная) суспензия головного отдела термитов; 6 – фильтровальная (центрифугированная) суспензия грудно-брюшного отдела термитов; 7 – чистый ферментный препарат (контроль)

Обсуждение. Термиты играют важную роль в деградации целлюлозных материалов в природе, и особое внимание уделяется активности и экспрессии термитных целлюлаз [6]. Эффективное переваривание целлюлозы у термитов требует как эндогенных, так и кишечных микробных целлюлаз. Настоящее исследование показало, что грудная и брюшной части являются основным местом переваривания целлюлозы у термитов, что согласуется с сообщением. Что касается динамического сдвига у термитов, то наши результаты показали, что активность ЭГ и деградирующая активность фильтровальной бумаги были наиболее сильно сосредоточены в кишке изученных термитов, чем у других образцов (части тела, образцы I и II) термитов, что подтверждают исследования ЭГ [2], динамическое изменение целлюлазной активности подтверждают соответствующие отчеты A. Fujita, T. Miura, T. Matsumoto (2008) и G. Tokuda (2009). Они предположили, что основное положение активности к голове/передней кишке с эволюцией древесных термитов и эволюционировавшие древесные термиты, такие как термиты Rhinotermitidae и Termitidae, могут иметь более высокую активность БГ в грудной части тела термита.

Что касается сравнения активности целлюлазы в целых телах термитов, то было высказано предположение, что деградирующая активность фильтровальной бумаги и процентное содержание CBH в полных целлюлазах увеличиваются со средним повышением эволюционного статуса.

Полученные данные показывают, что (рис. 1.) полученные суспензии от разных мест тела термитов после фильтрования наиболее гидролизуют целлюлозу в виде фильтровальной бумаги, чем суспензии без фильтрования. Это тоже доказывает, что наличие разных веществ в составе субстрата отрицательно влияет на биодеградацию образцов целлюлозы (в виде фильтровальной бумаги).

Из полученных данных можно сделать вывод о том, что целлюлазная активность в грудной и брюшной части термита постепенно уменьшается. Это явление можно объяснить тем, что в составе полученной суспензии имеются разные примеси и они могут влиять на целлюлазную активность, так как неоднократно было доказано, что на активность целлюлазы могут влиять мультиномиальные факторы, такие как ­температура, субстрат, состояние и состав субстрата [7].

Список литературы:

1. Correlation of cellulase gene expression and cellulolytic activity throughout the gut of the termite Reticulitermes flavipes / Nakashima [et al.], 2002; Tokuda [et al.], 2007; Zhou [et al.], 2007.
2. Lo N., Tokuda G., Watanabe H. Evolution and function of endogenous termite cellulases // Biology of Termites: a modern synthesis / D.E. Bignell [et al.] (eds.). – London – New York : Springer Science + Business Media, 2011. – P. 51–67.
3. Major alteration of the expression site of endogenous cellulases in members of an apical termite lineage / G. Tokuda, N. Lo, H. Watanabe, G. Arakawa [et al.] // Molecular Ecology. – 2004. – № 13 (10). – P. 3219–3228.
4. Nelson M.I., Kelsey R.G., Shafizaden F. Anhancement enzymatic hydroly-ses by Simultaneus attrition of cellulosed Substrates // Bio-technol and Bioeng. – 1982. – Vol. 24. – P. 293– 294.
5. Tokuda G., Lo N., Watanabe H. Marked variations in patterns of cellulase activity against crystalline- vs. carboxymethyl-cellulose in the digestive systems of diverse, woodfeeding termites // Physiological Entomology. – 2005. – № 30 (4). – P. 372–380.
6. Watanabe H., Tokuda G. Cellulolytic systems in insects // Annual review of entomology. – 2010. – № 55. – P. 609–632.
7. Willis J.D., Oppert C., Jurat-Fuentes J.L. Methods for discovery and characterization of cellulolytic enzymes from insects // Insect Science. – 2010. – № 17 (3). – P. 184–198.