ВЛИЯНИЕ БИОСТИМУЛЯТОРОВ НА АНТИОКСИДАНТНЫЙ СТАТУС НОВЫХ СОРТОВ ХЛОПЧАТНИКА В УСЛОВИЯХ ЗАСОЛЕНИЯ

АННОТАЦИЯ

 Изучено влияние различных концентраций 10^-6, 10^-7, 10^-8 М биостимулятора ДАГ-1 на функционирование про-/антиоксидантной системы в 7-суточных проростках хлопчатника - Порлок-1 и Равнак-1 в условиях солевого стресса. В качестве эталона использован коммерческий стимулятор Biodux. На основе изучения содержания Н₂О₂, малонового диальдегида (МДА), активности ферментов-антиоксидантов супреоксиддисмутазы (СОД), пероксидазы (ПО), каталазы (КАТ) выявлено, что Порлок-1 предобработанный биостимулятором ДАГ-1 в концентрациях 10^-6 и 10^-7 М был адаптирован действию солевого стресса. Препарат Biodux стимулировал про-/антиоксидантную систему исследуемых сортов хлопчатника, однако на фоне 100 мМ NaСl предобработка эталонным стимулятором не оказывала антиокислительного действия. Сопоставление про- и антиоксидантных процессов в сортах хлопчатника показало, что предобработка семян хлопчатника биостимулятором ДАГ-1 индуцирует антиоксидантную систему и смягчает воздействие солевого стресса.

ABSTRACT

 The effect of various concentrations of 10^-6, 10^-7, and 10^-8 M biostimulant DAG-1 on the functioning of the pro / antioxidant system in 7-day-old cotton seedlings of varieties - Porlok-1 and  Ravnak-1 under conditions of salt stress. The commercial stimulant Biodux was used as a reference. Based on the study of the content of H₂O₂, malondialdehyde (MDA), the activity of the antioxidant enzymes superoxide dismutase (SOD), peroxidase (PO), catalase (CAT) it was found that pretreatment with the biostimulant DAG-1 at concentrations of 10^-6 and 10^-7 M reduced salt stress in Porlok-1. Biodux stimulated the pro- / antioxidant system of all studied cotton varieties; however, at 100 mM NaCl the pretreatment with the reference stimulator did not have an antioxidant effect. Comparison of pro- /antioxidant processes in different biotechnological cotton varieties showed that pretreatment of cotton seeds with a biostimulant DAG-1 induces an antioxidant system and mitigates salinity stress.

Ключевые слова: хлопчатник, антиоксиданты, биостимуляторы, перекись водорода, малоновый диальдегид.

Keywords: cotton, antioxidants, biostimulants, hydrogen peroxide, malondialdehyde.

Изменение климата вызывает потери производительности культур, что является серьезной проблемой для сельскохозяйственного сектора. Генмодифицированные культурные растения, могут не устоять при множественных стрессах на полевом уровне [1]. В качестве альтернативного решения для «подготовки» растений к будущим стрессам широко распространено использование биостимуляторов растений для повышения урожайности сельскохозяйственных культур.

Среди различных категорий биостимуляторов - один из успешных в хлопководстве Узбекистана - препарат ДАГ-1. Новый биостимулятор влияет на устойчивость и адаптивность хлопчатника к стрессам различного рода за счет стимулирования антиоксидантной системы растений.

Солевой стресс вызывает накопление АФК. Чтобы поддерживать баланс между продукцией и поглощением АФК, в растениях выработаны системы утилизации АФК. Основными компонентами обезвреживающие АФК являются ферменты СОД, КAT, ПО [2].

Мы предположили, что предпосевная обработка семян биостимулятором ДАГ-1 может смягчать воздействие солевого стресса. Следовательно, изучение про-/антиоксидантного статуса хлопчатника в условиях засоления является важным для оценки действия препаратов природного происхождения и химических средств на уровень продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), Н₂О₂, активности ферментов-антиоксидантов - СОД, ПО, КАТ.

Материалы и методы

Семена хлопчатника ген-нокаутного сорта Порлок-1 и сорта маркер ассоциированной селекциии (МАС) Равнак-1 были предоставлены Центром геномики и биоинформатики, препарат ДАГ-1 (супрамолекулярный комплекс глицирризиновой и салициловой кислот), был разработан в Институте биоорганической химии имени А.С. Садыкова АН РУз. В качестве эталона использовали промышленный стимулятор Biodux (арахидоновая кислота – цис-5,8,11,14-эйкозатетраеновая кислота).

Семена хлопчатника оголяли концентрированной серной кислотой, промывали под струей холодной воды и выдерживали 8 ч в различных концентрациях (10^-6, 10^–7, 10^-8 М) препарата ДАГ-1, а также в 0,03 % растворе эталонного стимулятора Biodux. Семена, завернутые в бумажные “рулоны”, помещали в отдельные сосуды с раствором NaCl (100 мМ) и проращивали в термостате при 26°C в течение 7-суток. Проростков гомогенизировали в присутствии жидкого азота. Сумму белков экстрагировали 0.1 М фосфатным буфером, рН 6.6, содержащем 0.5 М NaCl (1:3), в течение 1 часа на магнитной мешалке при 4⁰С. Центрифугировали при 5000 об/мин в течение 20 мин.

Общую активность СОД определяли по методу Гианнополитиса и Райса [3]. Активность ПО определяли по методу Бояркина [4]. Содержание белка определяли по методу Лоури [5]. Активность КАТ определяли по методу Sinha [6]. Содержание МДА оценивали по методу В.В. Рогожин [7]. Определение содержания Н₂О₂ проводили методом Великовой [8].

Полученные данные были подвергнуты дисперсионному анализу (ANOVA) с использованием пакета программ OriginPro 7.0. Данные представлены как средняя стандартная ошибка трех повторностей.

Результаты и обсуждение

Исследования показали неоднозначность результатов по функционированию про-/антиоксидантной системы в 7-суточных проростках сортов хлопчатника Порлок-1 и Равнак-1 при солевом стрессе и воздействии малых концентраций (10^-6 - 10^-8 М) биостимулятора ДАГ-1 на фоне 100 мМ NaСl, которые связанны с сортоспецифичностью ответных реакций. В сравнительном аспекте было исследовано влияние промышленного стимулятора Biodux.  Как видно из приведенных результатов в табл.1, разные генотипы имеют разный уровень Н₂О₂. Высокий уровень Н₂О₂ наблюдался у сорта Равнак-1 (ДАГ-1 (10^-7 М)). Воздействие 100 мМ NaCl в сортах хлопчатника снижало уровень Н₂О₂.

Таблица 1.

Содержание Н₂О₂ и МДА в 7-суточных проростках хлопчатника предобработанных стимуляторами

ДАГ-1 (10^-6, 10^-7, 10^-8 М), Biodux на фоне 100 мМ NaCl, (n=3, M±m)

Примечание: **- означает значение ниже уровня контроля; *- означает значение ниже уровня NaCl 100 мМ. В таблице представлены средние значения и их стандартные отклонения, различия достоверны при Р≤0,05.

Предобработка семян препаратом ДАГ-1 в концентрации 10^-6 и 10^-7 М увеличивали концентрации Н₂О₂ в исследуемых сортах. Накопление H₂O₂ может быть сигналом для инициирования адаптивного ответа на стресс [9]. В тоже время концентрация 10^-8 М у сорта Порлок-1 незначительно увеличивала содержание H₂O₂, тогда как содержание Н₂О₂ при этом снижалось у сорта Равнак-1 по сравнению с контролем и заметное понижение при воздействии стимулятора Biodux. На фоне 100 мМ засоления предобработка семян стимуляторами ДАГ-1 (10^-6 - 10^-8 М) и Biodux способствовали ингибированию выработки H₂O₂ у сорта Равнак-1. Понижение уровня Н₂О₂, по нашим предположениям, является следствием функциональной активности антиоксидантных ферментов, которая хорошо согласуется с низким уровнем ПОЛ. Перекисного окисления липидов мембран растительных клеток, индуцированное АФК отражает вызванное стрессом повреждение на клеточном уровне в следствии накопления конечного продукта МДА и является показателем развития окислительного стресса растений [10]. В связи с этим изучалось влияние биостимуляторов на содержание МДА (табл.1). Под воздействием 100 мМ NaCl в сортах повышался уровня МДА. Несмотря на низкий уровень H₂O₂ при действии 100 мМ NaCl повышение содержания МДА может быть следствием накопления более токсичной молекулы чем Н₂О₂ - гидроксильного радикала (HO₂ ^-), способный проходить через мембраны и отбирать атомы водорода у полиненасыщенных жирных кислот и липидов, тем самым запускать самоокисление липидов [11]. Нужно отметить, что содержание МДА при концентрации ДАГ-1 10^-7 М у сорта Порлок-1 и Равнак-1 было ниже, чем при воздействии только 100 мМ NaCl. Хотя значения содержания МДА исследуемых сортов в некоторых вариантах применения биостимуляторов превышал значения в контрольных растениях, показатель окислительного стресса у предобработанных биостимулятором растениях в условиях засоления был ниже, чем при воздействии одного 100 мМ NaCl.

На фоне засоления концентрации биостимулятора ДАГ-1 10^-6 и 10^-8 М способствовали понижению уровня МДА у Равнак-1. Понижение уровня окислительного повреждения мембран связано с функционированием ферментов КАТ, СОД, ПО, активность которых индуцировалось стимулятором ДАГ-1. Содержание МДА повышалось у сортов предобработанных Biodux по сравнению с контрольными образцами, однако, при этом содержание МДА было низким по сравнению с образцами под воздействием 100 мМ NaCl. На фоне засоления в сортах предобработка Biodux не защищала растения от окислительного стресса, о котором свидетельствовало повышение уровня МДА. Согласно мнению Bowler, это связано со снижением активности КAT и результатом реакции Haber–Wesis с образованием гидроксильных радикалов [12].

Далее была исследована сравнительная активность антиоксидантных ферментов у сортов хлопчатника при действии биостимуляторов в условиях солевого стресса.

Таблица 2.

Активность антиоксидантных ферментов в 7-суточных проростках хлопчатника предобработанных стимуляторами

ДАГ-1 (10^-6, 10^-7, 10^-8 М) и Biodux на фоне 100 мМ NaCl, (n=3, M±m)

Примечание: **- означает значение выше уровня контроля; *- означает значение выше уровня NaCl 100 мМ. В таблице представлены средние значения и их стандартные отклонения, различия достоверны при Р≤ 0,05.

Солевой стресс повышал активность КАТ у сорта Равнак-1 и ПО активность у сорта Порлок-1 (табл. 2). При этом активность СОД была ниже уровня контроля. Это указывает на компенсаторную функцию антиоксидантных ферментов в ответ на активность процессов ПОЛ.

При обработке семян Порлок-1 биостимулятором ДАГ-1 в проростках наблюдалось увеличение активности трех ферментов при концентрациях 10^-6 и 10^-7 М, при действии концентрации 10^-8 М повышалась активность СОД и ПО. Повышение активности ферментов совпадало с понижением уровня МДА. Обработка биостимулятором ДАГ-1 в концентрации 10^-6 и 10^-7 М семян сорта Равнак-1 индуцировала активности КАТ и СОД, а концентрация 10^-8 М активность только КАТ, в результате которого уровень МДА снижался.

Предобработка семян препаратом ДАГ-1 в концентрации 10^-6 М с последующим проращиванием в 100 мМ NaCl индуцировала активность ПО в проростках Порлок-1, а также активность КАТ и СОД у Равнак-1. При концентрации 10^-7 М в условиях засоления повышалась активность КАТ и СОД у сорта Равнак-1, а совместное воздействие засоления и биостимулятора ДАГ-1 при концентрации 10^-8 М повышала активность КАТ.

Было выявлено, что обработка семян стимулятором Biodux повышала активность КАТ и СОД в проростках Порлок-1. У Равнак-1 обработка семян стимулятором повышала активность только КАТ. В этих сортах соответственно были низкие уровни Н₂О₂ и МДА. На фоне 100 мМ NaСl стимулятор Biodux повышал активность СОД и ПО у сорта Порлок-1, в то время как повышение активности только КАТ отмечалось у сорта Равнак-1 по сравнению с контролем.

Предобработка семян исследуемых сортов стимулятором Biodux и разными концентрациями биостимулятора ДАГ-1 на фоне 100 мМ NaСl индуцировали активность ферментов, а в некоторых случаях ингибировали их активность. Это связано с тем, что ферменты расположены в различных тканевых структурах и клеточных компартментах, имеют разную субстратную специфичность и сродство к АФК. При действии стрессов на растения может произойти быстрая инактивация конститутивного пула антиоксидантных ферментов [13].

Анализируя данные с позиции чувствительности про-/антиоксидантной системы новых биотехнологических сортов хлопчатника при обработке семян препаратом ДАГ-1 и воздействии засоления были выявлены различия в накоплении Н₂О₂ и МДА, активности ферментов СОД, КАТ, ПО, которые могут отражать сортоспецифичность в механизмах защитного ответа к повреждающему действию окислительного стресса и стресс-смягчающего эффекта малых концентраций биостимулятора. Было установлено, что сорт Порлок-1 предобработанные препаратом ДАГ-1 в концентрации 10^-6 и 10^-7 М был адаптирован действию солевого стресса. Препарат Biodux стимулировал про-/антиоксидантную систему исследуемых сортов хлопчатника, однако на фоне 100 мМ NaСl предобработка эталонным стимулятором не оказывала антиокислительного действия. Сопоставление про-/антиоксидантных процессов в сортах хлопчатника показало, что предобработка биостимулятором ДАГ-1 индуцирует антиоксидантную систему и смягчает воздействие солевого стресса.

Проведенные нами исследования дают основу для разработки конкретных рекомендаций по применению препаратов нового поколения и пестицидов для каждого генотипа хлопчатника с учетом их антиоксидантного статуса с целью повышения адаптивности в условиях засоления.

Благодарность:

Авторы выражают благодарность Центру геномики и биоинформатики за безвозмездное предоставление семян биотехнологических сортов хлопчатника Порлок-1 и Равнак-1 в проведении научных экспериментов.

Список литературы:

1. Faisal Z., Muhammad A. Bioregulators: unlocking their potential role in regulation of the plant oxidative defense system // Plant Molecular Biology. 2021. – V.105. -P.11–41.
2. Arif Y, Singh P, Siddiqui H, et al. Salinity induced physiological and biochemical changes in plants: an omic approach towards salt stress tolerance // Plant Physiol Biochem. 2020. – V.156. – P.64–77.
3. Giannopolitis C.N., Ries S.K. Superoxide dismutase I. Occurrence in higher plants // Plant Physiol. 1972. - V. 59. - P. 309-314.
4. Бояркин А.Н. Быстрый метод определения активности пероксидаз // Биохимия. 1951. - Т.16. - № 6. – С.352-355.
5. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. // J.Biol. Chem. 1951. V.193 - №2. - P. 265.
6. Sinha, K.A. (1972) Colorimetric Assay of Catalase. Analytical Biochemistry, 47, 389-394.
7. Kumar G.N.M., Knowles N.R. Changes in lipid peroxidation and lipolitic and free radical scavenging enzyme activities during aging and sprouting of potato (Solanum tuberosum) seed-tubers // Plant. Physiol. 1993. – V.102. – P. 115-124.
8. Velikova V., Yordanov I., and Edreva A. Optimized assay for hydrogen peroxide determination in plant tissue using potassium iodide // American Journal of Analytical Chemistry. 2014.- V.5. – P.730-736.
9. Gosset D.R., Millhollon E.P., Lucas M.C. Antioxidant response to NaCl stress in salt-tolerant and salt-sensitive cultivars of cotton // Crop Sci. 1994. – V.34. -P.706–714.
10. 10.Shukla N., Awasthi R.P., Rawat L. and Kumar J. Biochemical and physiological responses of rice (Oryza sativa L.) as influencced by Trichoderma harzinaum under drought stress // Plant Physiol. Bioch. 2012. – V.54. – P.78-88.
11. Demiral T., Turkan I. Comparative lipid peroxidation, antioxidant defense systems and proline content in roots of two rice cultivars differing in salt tolerance // Environ. exp. Bot. 2005. -V.53. – P.247-257.
12. Bowler C., Montagu M.V. and Inze D. Superoxide dismutase and salt stress tolerance // Ann. Rev. Plant Physiol. 1992. – V.43. – P.83-116.
13. Гарифзянов А.Р., Жуков Н.Н., Иванищев В.В. Образование и физиологические реакции активных форм кислорода в клетках растений // Современные проблемы науки и образования.  2011. – № 2. -C.21