Сохранность антагонистических свойств актиномицетов при хранении различными методами

АННОТАЦИЯ

Изучена сохранность антагонистической активности коллекционных штаммов актиномицетов рода  Streptomyces - Str. roseoflavus шт.33, Str. alboflavus шт.7, Streptomyces. sp.700 к основным фитопатогенам хлопчатника Verticillium dahliaе, Fusarium solani, Fusarium oxysporum при хранении различными методами (периодические пересевы, в стерильном песке, глицерине, дистиллированной воде в течение 8 лет. Показано, что все изученные штаммы актиномицетов при всех использованных методах хранения сохранили антагонистическую активность к фитопатогенам, активно ингибировали развитие патогенов (20-35 мм). Streptomyces roseoflavus шт.33, Streptomyces sp. 700, при всех использованных методах хранения сохраняли активность по отношению ко всем патогенам.

ABSTRACT

The preservation of the antagonistic activity of collection strains of actinomycetes of the genus Streptomyces - Str. roseoflavus item 33, Str. alboflavus pcs. 7, Streptomyces. sp. 700 to the main phytopathogens of cotton Verticillium dahliaе, Fusarium solani, Fusarium oxysporum during storage by various methods (periodic replantings, in sterile sand, glycerin, distilled water after 4 years. phytopathogens, actively inhibited the development of pathogens (20-35 mm) Streptomyces roseoflavus pcs 33, Streptomyces sp. 700, in all storage methods retained the ability to all pathogens.

Ключевые слова: Актиномицеты, стрептомицеты, микроскопические грибы, фитопатогены, антагонисты, хранение, периодический пересев,  стерильный песок, глицерин, дистиллированная вода.

Keywords: Actinomycetes, streptomycetes, microscopic fungi, phytopathogens, antagonist, storage, periodic replanting, sterile sand, glycerin, distilled water.

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время, хранение микроорганизмов осуществляется в коллекциях, и используется как в промышленных, так и в исследовательских целях. Разработка эффективных приемов консервации культур микроорганизмов связана с возрастающей потребностью науки и промышленности: постоянно иметь в своем распоряжении высоко активные, жизнеспособные и стабильные по своим показателям культуры микроорганизмов.

Выбор эффективного способа хранения конкретного микроорганизма должен основываться, прежде всего, на сохранности морфологических, культуральных признаков, физиологической активности, сохранении максимального числа жизнеспособных клеток, то есть, в состоянии близком к естественному, а также проведении периодического и системного анализа по влиянию сохранности исходных свойств. 

Целью настоящего исследования являлось изучение влияния различных методов хранения на антагонистическую активность актиномицетов коллекционного фонда.

В последние годы в системе защиты растений от фитопатогенов расширяется ассортимент биологических препаратов на основе применения микроорганизмов с различной антагонистической активностью в отношении основных возбудителей болезней растений, поэтому сохранение их в коллекции весьма актуально.

Растения взаимодействуют и с полезными микроорганизмами, особое внимание среди которых уделяется микроорганизмам-антагонистам фитопатогенов, которые являются продуцентами комплекса антибиотических веществ, обладающих высокой физиологической активностью. Они подавляют  рост целого ряда фитопатогенных грибов и бактерий, что позволяет антагонистам  достаточно быстро вытеснять из грунтов или субстратов патогенную микрофлору. Их антагонистические свойства используются в сельскохозяйственной биотехнологии для разработки и производства биологических средств защиты растений против ряда заболеваний, таких как корневые, прикорневые гнили злаковых растений и др. [1-6].

Многими исследователями установлено, что среди огромного разнообразия актиномицетов большое место занимают штаммы, образующие антибиотические вещества с фунгицидной, противоопухолевой, антивирусной и другими активностями.  Важной характеристикой  некоторых из них являются способность стимулировать рост, развитие и устойчивость растений к фитопатогенам. Отмечено, что они оказывают не только терапевтическое, но и профилактическое действие в предупреждении развития заболеваний растений [7-9].

Авторами изучена ризосфера различных растений (пшеницы, кукурузы, хлопчатника, люцерны и огурцов), культивируемых в Сурхандарьинской области. Проведен скрининг среди выделенных 56 штаммов актиномицетов и 33 штаммов микроскопических грибов по антагонистической способности к возбудителям болезней растений. Из них антагонистической активностью к изученным патогенам обладали 20 штаммов рода Streptomyces и 17 микроскопических грибов родов Aspergillus,  Penicillium, Fusarium. Отобраны микроорганизмы -  2 активных штамма актиномицетов и 3 микроскопических грибов, обладающие антагонистической  и ростстимулирующей  способностью [10,11].

Золотилиной  Г.Д. с соавторами [12, 13] изучено микробное сообщество корневой системы хлопчатника при использовании комплексного микробного препарата Вербактин для биоконтроля  вертицеллезного вилта хлопчатника. В состав препарата входят микроорганизмы – бактериальная культура Bac.licheniformis 234 и актиномицетный штамм Streptomyces roseoflavus шт.33, коллекционного фонда Института микробиологии АН РУз. Показана высокая активность микроорганизмов, обладающих высокой антагонистической способностью к различным фитопатогенам и не ингибирующее действие на полезную микрофлору.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом для исследования служили актиномицеты коллекционного фонда, выделенные из различных субстратов Узбекистана и сохраняемые различными методами в коллекции в течение длительного времени.

Хранение микроорганизмов осуществляли методами периодического пересева на свежие питательные среды, в стерильном песке, глицерине и дистиллированной воде.

Актиномицеты выращивали в чашках Петри на среде Чапека (г/л: сахароза–20,0; NaNO₃–2,0; K₂HPO₄–1,0; MgSО₄–0,5; вода дистиллированная–1; рН 7,2-7,4) в течение 7 суток, при температуре 37 ^оС [14, 15].

Тест культурами являлись микроскопические грибы - фитопатогены хлопчатника Verticillium dahliaе, Fusarium solani, Fusarium oxysporum. 

Антагонистическую активность изучали методом агаровых блоков [16].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В коллекции Института микробиологии АН РУз хранятся 76 штаммов актиномицетов-антагонистов, которые в 2012г. были переведены на различные методы хранения (периодические пересевы, в глицерине (-20^оС), дистиллированной воде, стерильном песке, под слоем вазелинового масла).  В таблице 1 приводятся наиболее активные стрептомицеты, имеющие антагонистическую активность к фитопатогенам.

Таблица 1.

Промышленно-важные актиномицеты, с высоким биотехнологическим потенциалом

Каждый год проводятся исследования по изучению сохранности жизнеспособности и антагонистической активности актиномицетов коллекционного фонда при хранении различными методами.

Ранее нами был проведен скрининг среди коллекционных культур (76 штамма) на выявление антагонистических свойств по отношению к фитопатогенам хлопчатника. Показано, что из апробированных 76 коллекционных культур актиномицетов родов Streptomyces и Streptoverticillium, 36 штаммов угнетали рост фитопатогенов, зона подавления роста составляла  от 20 до 55 мм в диаметре.

В наших исследованиях изучена сохранность антагонистической активности промышленно-важных штаммов стрептомицетов Str.аlboflavus 7, Str.roseoflavus 33, Streptomyces sp.шт. 700 при хранении различными методами через 8 лет. Тест-культурами являлись основные фитопатогены хлопчатника – Verticillium dahliaе, Fusarium solani, Fus. oxysporum.

Исследования показали, что все изученные штаммы актиномицетов при всех методах хранения сохраняли антагонистическую активность к фитопатогенам и активно ингибировали развитие патогенов. Как видно из данных таблицы 2 и рис.1, 2, 3, зона ингибирования роста патогена достигает значительных величин – от 20 до 35 мм. Str.roseoflavus 33, Streptomyces sp. шт. 700 при всех  методах хранения сохраняли способность ко всем патогенам.  При хранении в глицерине (-20 ^оС)  активность была выше (35 мм), чем исходного (метод периодического посева) к Verticillium dahliaе.

Культура Streptomyces alboflavus 7 при всех способах хранения сохраняла активность ко-всем изученным патогенам. При хранении в стерильном песке активность выше, чем у исходного к Fusarium solani и F.oxysporum (30мм).

Полученные данные подтверждают, что для сохранения жизнеспособности и антагонистической активности культуры актиномицетов Streptomyces roseoflavus 33, Streptomyces sp. 700  с успехом могут храниться в глицерине (-20^оС).

Таблица 2.

Антагонистическая активность актиномицетов к фитопатогенам

Рисунок 1. Антагонистическая способность  стрептомицетов (хранение в глицерине) к фитопатогенам

Рисунок 2. Антагонистическая способность  актиномицетов (хранение в стерильном песке) к фитопатогенам

Рисунок 3. Антагонистическая способность  актиномицетов (хранение в дистиллированной воде) к фитопатогенам

Выявление сохранности высокой активности актиномицетов - продуцентов биологически активных соединений, является практически важным показателем для рекомендации их практического применения, использования в научных исследованиях, отраслях сельского хозяйства, промышленности, медицине и разработках новых биодобавок, биопрепаратов.

Список литературы:

1. Воронин А.М. Ризосферные бактерии рода Pseudomonas, способствующие росту и развитию растений // Соросовский образ, журн. - 1998. - Т. 35 - № Ю. - С. - 25-32.
2.  Голованова Т.И., Долинская Е.В., Костицыны Ю.Н. Влияние грибов рода Trichoderma на ростовые процессы растений пшеницы //Электронный ресурс. - Исследовано в России: электрон, научн. журн. http: // zhurnal. аре. relam. ru.articles. - 2008. - 013. - pdf. 10 с.
3. Голованова Т.И., Долинская Е.В., Сичкарук Е.А. Взаимоотношения почвенного гриба Trichoderma и яровой пшеницы // Вестник Крас ГАУ. - 2009. - Т. 7.  - С. 102-107.
4. Голованова Т.И., Литовка Ю.А., Долинская Е.В., Сичкарук Е.А., Валиулина А.Ф., Схиладзе O.Л. Взаимоотношения пшеницы с микроорганизмами прикорневой зоны растений // Вестник Крас ГАУ. Красноярск. - 2010. - Т. 9. - С. 90-97
5. Кацы Е.И. Молекулярная генетика ассоциативного взаимодействия бактерий и растений: состояние и перспективы исследований. - М.: Наука - 2007. - 86 - с. 127
6. Berg G. Plant-microbe interactions promoting plant growth and health: perspectives for controlled use of microorganisms in agriculture // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2009. -  Vol. 84. -  P. 11-18.
7. Chater K.F. Streptomyces inside-out: a new perspective on the bacteria that provide us with antibiotics. // Philos Trans R SocLond B Biol Sci. – 361 -  761-768 - 2006.
8. Звягинцев Д.Г., Зенова Г.М. //Экология актиномицетов. - М.: ГЕОС, - 2001 - 257 с.
9.  Raaijmakers J.M., Vlami M., de Souza J.T. Antibiotic production by bacterial biocontrol agents. //Antonie Van Leeuwenhoek – 81 -(1-4) - 537-547 - 2002.
10. Бекмухамедова Н.К., Бахтиерова М.С. Антагонистическая и ростстимулирующая способность микроорганизмов, выделенных из ризосферы сельскохозяйственных растений // Труды Института микробиологии Национальной Академии Наук Азербайджана. - Т.11 - № 1, Баку - 2013. - С.408 - 413
11. Бекмухамедова Н.К., Ташпулатов Ж.Ж., Ходжибаева С.М. Актиномицеты ризосферы хлопчатника – антагонисты грибных и бактериальных фитопатогенов. // Материалы 4 Московского Биотехнологического конгресса. - 2007. -  с.326.
12. Золотилина Г.Д., Ходжибаева С.М., Федорова О.А. Микробное сообщество корневой системы хлопчатника при использовании комплексного микробного препарата //Труды Института микробиологии Национальной Академии Азербайджана 2012. - Т.10 - №1 - С.127-130.
13. Золотилина Г.Д., Ходжибаева С.М., Федорова О.А., Ташпулатов Ж.Ж. «Штамм Bacillus licheniformis-234 для защиты  хлопчатника  от  вертициллезного вилта и стимуляции роста хлопчатника  // Патент № IAP 04648. -  20.05.2014 г.
14. Егоров Н.С. Руководство к практическим занятиям по микробиологии - М.: Изд. МГУ - 1995. - 205с.
15. Нетрусов А.Н. Практикум по микробиологии под ред. - М.: «Академия» - 2005. - 600c.
16. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. - М: Изд. МГУ, 2003. -  С.104.