Исследования антиоксидантных свойств некоторых растворимых форм супрамолекулярных комплексов на основе моноаммониевой соли глицирризиновой кислоты

АННОТАЦИЯ

Исследован антиоксидантный эффект супрамолекулярных комплексов на основе моноаммонивой соли глицирризиновой кислоты (МАСГК) в гомогенате и митохондриях печени крыс на модели парацитомолового гепатита. Установлено, что парацетамол вызывает значительное увеличение в гомогенате печени диеновых коньюгатов и сопряженных триенов, а также в митохондриях вторичного продукта перекисного окисления липидов (ПОЛ). Введение гепатитным животным супрамолекулярных комплексов снижало содержание первичных и вторичных продуктов ПОЛ. Наиболее эффективным антиоксидантным действием обладал комплекс МАСГК/кверцитин.

ABSTRACT

The antioxidant effect of supramolecular complexes based on the monoammonium salt of glycyrrhizin acid (MASGA) in the homogenate and mitochondria of rat liver was studied using a model of paracetamolic hepatitis. It was found that paracetamol causes a significant increase in the liver homogenate of diene conjugates and conjugated trienes, as well as in the mitochondria of the secondary product of lipid peroxidation (LPO). Administration of supramolecular complexes to hepatitis animals reduced the content of primary and secondary LPO products. The most effective antioxidant effect was shown by the (MASGA)/quercetin complex.

Ключевые слова: гепатит, парацетамол, перекисное окисление липидов, митохондрии, малоновый диальдегид, диеновые коньюгаты, полифенолы, моноаммониевая соль глицирризиновой кислоты, аминокислоты

Keywords: hepatitis, paracetamol, lipid peroxidation, mitochondria, malondialdehyde, diene conjugates, polyphenols, glycyrrhizin acid monoammonium salt, amino acids.

Гепатиты представляют одну из наиболее серьезных и актуальных проблем современного здравоохранения. Известно, что при гепатитах различной этиологии чрезвычайно высок риск развития циррозов печени и первичного рака печени. К 2020 году число больных различными видами гепатитов возросло до 450 млн. человек. Ежегодно в мире от гепатитов умирает около 1 млн. человек. В последние годы в некоторых странах Средиземноморья и Азии отмечено преобладание вялотекущих форм гепатита [1], при котором наблюдается изменение иммунной системы, вызывающее активацию провоспалительных цитокинов и деструктивных процессов в гепатоцитах [2]. В большинстве случаев поражения печени, в том числе при инфекции гепатотропными вирусами, в основе гибели клетки лежит апоптоз [3]. Известно, что одной из ключевых органелл в запуске, реализации и регуляции апоптоза, является митохондрия, что делает её значимой мишенью в исследованиях, посвященных гепатитам. Доказано, что гепатиты сопровождаются разнообразными метаболическими изменениями и симптоматикой. Для лечения гепатитов используют гепатозащитные средства, препятствующие развитию метаболических, функциональных и структурных нарушений в клетках печени. Эффективность многочисленных гепатопротекторных средств, несмотря на их положительное воздействие на основные синдромы гепатита, все же остается невысокой. Причем, большинство применяемых в клинической практике гепатопротекторов являются дорогостоящими, т.к. выпускаются за рубежом, они малодоступны для широких слоев населения.

В связи с этим необходимость поиска новых, эффективных отечественных средств гепатопротекторного действия для лечения заболеваний печени является актуальной проблемой.

В настоящее время успехи в разработке новых лекарственных средств связаны не только с синтезом новых химических соединений, но и, в значительной степени, с улучшением свойств существующих препаратов, в том числе, путем создания новых лекарственных форм с направленной доставкой к органу-мишени [4, 5]. Одним из перспективных подходов в разработке подобных лекарственных форм является связывание действующего вещества в молекулярный комплекс с растительными углеводсодержащими метаболитами, который обеспечивает защиту базового препарата от быстрого метаболизма в организме и улучшает его транспорт через биологические мембраны [6]. Кроме этого, комплексообразование позволяет пролонгировать эффект действующего вещества за счет повышения аффинности к рецептору органа-мишени. К настоящему времени наиболее изученным в качестве комплексирующего растительного углеводсодержащего метаболита является глицирризиновая кислота, получаемая из корня солодки. В последние годы в клинической практике применяются различные медицинские препараты, содержащие производные глицирризиновой кислоты, получаемые из корня солодки и обладающие разнообразной биологической активностью в сочетании с низкой токсичностью. Они применяются в медицинской практике в качестве лекарственных препаратов широкого спектра действия. Используются комплексы и в качестве гепатопротекторов при лечении патологий печени различной этиологии [7].

Целью исследования является изучение супрамолекулярных комплексов, созданных на основе моноаммониевой соли глицирризиновой кислоты (МАСГК) с различными соединениями на процесс липопероксидации при экспериментальном токсическом гепатите, вызванном парацетамолом.

Материал и методы исследования

В работе были использованы белые беспородные крысы массой тела 160-180 г. обоего пола. Лекарственное поражение печени воспроизводили введением парацетамола в желудок в дозе 500 мг/кг в течение 2 дней [4]. Все животные были разделены на 11 групп. Первая группа контрольная; вторая группа – модельные животные, получавшие парацетамол. Третья группа - крысы, которым вводили 2,5 мг/кг комплекса МАСГК/DL - карнитин·HCl, условно обозначенное как соединение №1, четвертая - животные, получившие этот же комплекс в дозе 5,0 мг/кг (№2). В пятую группу вошли крысы, которым вводили комплекс МАСГК/Метион в дозе 2,5 мг/кг, обозначенное как соединение №3, а в шестую – животные, получившие этот же комплекс в дозе 5,0 мг/кг (№4). Седьмую группу составили животные, которым вводили 2,5 мг/кг комплексаМАСГК/Метоксикоричная кислота – соединение №5; восьмую – крысы, которым вводили 5,0 мг/кг комплекса (№6). В девятую и десятую группу вошли крыс, получавшие соответственно 2,5 и 5,0 мг/кг веса тела животного комплекс МАСГК/Кверцетин (соединения №7 и №8). Одиннадцатой группе животных вводили препарат сравнения СТД (соединение №9). В качестве препарата сравнения с высокими гепатопротекторными свойствами использовали инъекционное лекарственное средство Стронгер Нео-Минофаген С (Япония) (СТГ), имеющий в составе глицирризиновую кислоту и аминокислоты Глицин и L-Цистеин.

Супрамолекулярные комплексы и препарат сравнения вводили гепатитным животным в течение 7 дней. Супрамолекулярные комплексы были выделены и синтезированы в институте Биоорганической химии АН РУз.

Митохондрии из печени опытных и контрольных крыс выделяли общепринятым методом дифференциального центрифугирования [8].

В гомогенате печени животных всех групп определяли содержание превичных продуктов перекисного окисления липидов - диеновые коньюгаты (ДК) и сопряженные триены (СТ) [9]

Для определения содержания малонового диальдегида (МДА) – вторичного продукта ПОЛ в митохондриях печени осадок, содержащий митохондрии отмывали от сахарозы в среде, содержащей в мМ: 125 –КСl; 10 – трис – НСl, рН - 7,5. Количество образовавшегося МДА определяли, пользуясь значением коэффициента молярной экстинкции, равным 1,56. Концентрацию МДА выражали в нмоль МДА на мг белка [10]. Белок в пробах определяли по биуретовой реакции [11].

Результаты и их обсуждение

В механизме развития токсических поражений печени ведущее место принадлежит усилению процессов перекисного окисления липидов, вследствие которого происходит повреждение мембранных структур гепатоцита, изменение активности и синтеза мембраносвязанных ферментов, а также целого ряда внутриклеточных процессов, что может привести в конечном итоге к развитию цитолиза, который при тяжелых формах заканчивается декомпенсацией жизненно важных функций печени.

Первым этапом наших исследований явилось изучение первичных продуктов ПОЛ-диеновых коньюгатов (ДК) и сопряженных триенов (СТ) в гомогенате печени при токсическом гепатите, вызванном введением парацетамола и лечении различными супрамолекулярными комплексами. Данные представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Изменение содержания ДК и СТ печени крыс с токсическим гепатитом и введением различных комплексов (n=6; M±m)

Из представленных результатов установлено, что введение парацетамола привело к снижению выживаемости животных до 25%, вызывая токсический гепатит, характеризующийся увеличением в гомогенате печени почти в два раза первичных продуктов ПОЛ–диеновых коньюгатов и сопряженных триенов. Введение гепатитным животным препарата сравнения-СТД значительно снижало содержание первичных показателей ПОЛ. Все исследованные комплексы проявляли антиоксидантный эффект, выраженный в различной степени. Однако только соединения №7 и №8 снижали уровень ДК и СТ почти до контрольных значений.

Аналогичные результаты были получены и при определении содержания вторичных продуктов ПОЛ–малонового альдегида (МДА) в митохондриях печени интактных и гепатитных крыс. Токсический гепатит вызывал в митохондриях гепатоцитов увеличение скорости образования неферментативного-аскорбатзависимого МДА до 225%, ферментативного NADH-зависимого-до 244 % (табл. 2).

Таблица2.

Изменение содержания МДА в митохондриях печени крыс с токсическим гепатитом и введением различных комплексов (n=6; M±m)

Введение гепатитным животным СТД вызывало достоверное снижение обеих форм МДА на 70 и 86% соответственно. Из таблицы2 видно, что все исследуемые супрамолекулярные комплексы при 7-ти дневном введении, в разной степени, ингибировали процесс липопероксидации в митохондриях печени. В основном эффект изученных комплексов вполне сопоставим с действием препарата сравнения СТД. Однако, и в этой серии исследований было обнаружено, что среди изученных соединений комплекс МАСГК/Кверцетин (соединения №7 и №8) значительно превосходили антиоксидантный эффект СТД и других супрамолекулярных комплексов. Так, введение этого комплекса в дозе 5 мг/кг опытным крысам снижает процесс ферментативного и неферментативного ПОЛ на 80% и 111% соответственно. Остальные комплексы также снижают процесс липопероксидации, но эффект последних намного меньше эффекта препарата сравнения и комплекса МАСГК/Кверцетин в обеих исследованных дозах.

Таким образом, нами установлено, что токсический парацетамоловый гепатит вызывает увеличение процесса липопероксидации, которое снижалось при введении гепатитным животным различных супрамолекулярных комплексов. Очевидно, механизм возрастания интенсивности ПОЛ при токсическом поражении печени, заключается не только в повреждении мембран митохондрий, но при этой патологи и видимо страдают и процессы, протекающие в цитоплазме клеток печени.

Наши данные согласуются с результатами исследований других авторов, обнаруживших аналогичное повышение уровня ПОЛ при исследовании гомогената, мембран митохондрий и эндоплазматического ретикулума клеток печени при различных ее поражениях [12]. В патогенезе гепатитов, как токсического, так и острого большая роль отводится ускорению процессов липопероксидации, причем, по мнению многих авторов, концентрация продуктов ПОЛ, а также интенсивность индуцированного ПОЛ в сыворотке крови при гепатитах повышены в соответствии с выраженностью цитолитического синдрома и степени тяжести заболевания [13]. Большинство исследователей, занимающихся изучением процессов ПОЛ в развитии патологических процессов в печени, считают, что ключевая роль принадлежит интенсификации процессов перекисного окисления липидов. Усиление ПОЛ в мембранах гепатоцитов, или его полное ингибирование связаны, по их мнению, с нарушением равновесия про- и антиоксидантных систем [14]. Очевидно, в обоих случаях происходит отклонение от нормального функционирования этих систем, что одинаково опасно для клеток.

Кроме того, в различных биологических мембранах, в том числе и митохондриальных, вследствие интенсификации ПОЛ индуцируется проницаемость для различных ионов, неэлектролитов и макромолекул. Этот эффект потери мембранами барьерных функций лежит в основе развития токсических форм гепатита. В результате увеличения липопероксидации происходят изменения свойств таких мембранносвязанных ферментов, как Са²⁺-АТФаза, Na⁺/К⁺-АТФаза, цитохромы Р-450, в5, цитохром с, глюкоза-6 фосфатаза, моноаминооксидаза, фосфолипаза и др. Инактивация Са²⁺-АТФазы приводит к замедлению «откачивания» ионов Са²⁺ из клетки и одновременно к ускорению входа кальция в клетку. Это сопровождается увеличением внутриклеточной концентрации ионов Са²⁺ и повреждением клетки [15].

Для предотвращения подобной ситуации широко используются различные антиоксиданты. Поскольку процесс перекисного окисления развивается в виде цепных реакций в липидной фазе мембран и липопротеинов, а начальные (возможно и промежуточные) стадии этой сложной системы реакций протекают в водной фазе, то поиск водорастворимых антиоксидантов является весьма актуальным.

Такими соединениями могут быть флавоноиды и полифенолы растительного происхождения. Данные литературы об антиоксидантной активности веществ полифенольной природы указывают на перспективность поиска на их основе новых препаратов-антиоксидантов. Практически все фенольные соединения обладают антиоксидантной активностью. В частности, при их взаимодействии с окислительными радикалами образуются семихиноидные радикалы и ион-радикалы. В присутствии последних интенсивность пероксидации снижается. При этом активность полифенольных соединений зависит от количества гидроксильных групп в молекуле.

В наших экспериментах наибольшей антиоксидантной активностью обладал супрамолекулярный комплекс МАСГК/Кверцетин. Характерно, что общая картина нормализующего влияния этого и других изученных комплексов на состояние ПОЛ аналогична действию стандартного антиоксиданта-СТД, но по эффективности комплекс МАСГК/Кверцетин значительно превышает действие СТД, и может быть рекомендован для создания на его основе гепатопротекторного препарата.

Список литературы:

1. Rizetto M., Volpes R., Smedile A. Rerponse of pre-core mutant chronic hepatites B infection to poliphenols // J.Med.Vini. 2000.,61 p.398-402.
2. Ивашкин В.Т. Клеточная и молекулярная биология воспаления печени//Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, коллапроктологии. -1998. -№5. -С. 13-18.
3. Буеверов А.О., Грязин А.Е. Клинические аспекты изучения апоптоза при хронических вирусных гепатитах//Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, калопроктологии-2006. -№2.-С.4-10.
4. Толстиков Г.А., Болтина Л.А., Кондратен­ко P.M.Солодка: биоразнообразие, химия и применение в медицине. Новосибирск: НП Акаде­мическое изд-во "Гео", 2007.305С.
5. Liang B. L., Guo, J. Jin, Y. C. Ma, Z. Q. Feng. Glycyrrhizic acid inhibits apoptosis and fibrosis in carbon-tetrachloride-induced rat liver in jury. //World Journal of Gastroenterology -2015. - Vol. 21. P. 5271-5280.
6. Толстикова Т.Г., Сорокина И.В., Коваленко ИЛ., Толстиков А.Г. Влияние клатратообразования на активность фармакона в комплексах с глицирризиновой кислотой//Доклады АН. 2004. Т. 394. № 2.189-193
7. Доркина Е.К. Изучение гепатозащитного действия природных флавоноидных соединений//Экспериментальная и клиническая фармакология. 2004.-т.67. -№6. -С. 41-46.
8. Ichikawa K., Hashizume K., Yamada I. Ividence for induction by thyroid hormone of cytosolic proteins which control mitochondrial protein synthesis//Endocrinology, -1995.-v.117.-p.1749-1757.
9. Горячковский А.И. Справочное пособие по клинической биохимии. Одесса: ОКФА, 1994. - 415 с.
10. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. - М: Наука, - 1972. -139 с.
11. Scaffner W., Weisman C. A rapid sensitive and specific method for the determination of protein in delete solutione//Analyt. Biochem. -1973.- v.56.-p. 502-506.
12. Гогвадзе В.Г., Брустовский Н.Н., Жукова А.А. Участие фосфолипазы А в индуцированном продуктами перекисного окисления липидов разобщении митохондрий печени крыс//Биохимия - Москва, 1990. - т.55. вып.12-С.2195-2199.
13. Ивашкин В.Т. Болезни печени и желчевыводящих путей. М: ООО «Издательский дом м-Вести», 2002. - 416 с.
14. Владимиров Ю.А. Роль нарушения липидного слоя мембран в развитии патологических процессов//Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 1989. - №4. - С.7-17.
15. Рубин А.Б. Биофизика. М.: Изд-во Университет. -2000. - С.61-70.