ВЫДЕЛЕНИЕ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ ИЗ БАЗИДИОМИЦЕТА Innonotus Hispidus И ИХ АНТИРАДИКАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ

АННОТАЦИЯ

В данной статье изучен процесс выделения водорастворимых полисахаридов из базидиомицета Innonotus Hispidus и определены его оптимальные условия. Количественный анализ, молекулярная характеристика, моносахаридный состав водорастворимого полисахарида, выделенного методами физико-химического анализа, доказан исходный структурный строй и представлены результаты изучения острой токсичности и антирадикальной активности образцов. Водорастворимые полисахариды были выделены путем последовательного извлечения воды из базидиомицетного сырья и выход составил 9,44%. Установлено, что моносахаридный состав полисахарида следующий: фруктоза 6,68%, рамноза 3,37% и глюкоза 89,58%. В ИК-спектроскопии показано, что в спектре полисахаридов имеется диапазон 898-900 см-1 и присутствует гликозидная связь β-типа (β- (1,3) / (1,6)).

Результаты исследования показали, что изученные водорастворимые полисахариды проявляют антирадикальные свойства по отношению к радикалу дифенилпикрилгидразилу (ДФПГ).

ABSTRACT

This article examines the process of isolating water-soluble polysaccharides from the basidiomycete Inonotus hispidus and determines its optimal conditions. Quantitative analysis, molecular characterization, and monosaccharide composition of the water-soluble polysaccharide isolated by physicochemical analysis methods have confirmed its original structural arrangement. The results of studying the acute toxicity and antiradical activity of the samples are presented. Water-soluble polysaccharides were isolated by sequential water extraction from basidiomycetic raw materials and the yield was 9.44%. It has been established that the monosaccharide composition of the polysaccharide is as follows: fructose 6.68%, ramnose 3.37% and glucose 89.58%. IR spectroscopy shows that the polysaccharide spectrum has a range of 898-900 cm-1 and a β-type glycosidic bond (β- (1,3) / (1,6)).

Research findings demonstrated that the studied water-soluble polysaccharides exhibit antiradical properties against the diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) radical.

Ключевые слова: базидиальные грибы, экстракция, водорастворимые полисахариды, β-глюканы, гелевая хроматография, моносахаристый состав, ИК-спектроскопия, окислительный стресс, свободные радикалы.

Keywords: basidiomycetes, extraction, water-soluble polysaccharides, β-glucans, gel chromatography, monosaccharide composition, IR spectroscopy, oxidative stress, free radicals.

В настоящее время возрастает интерес к лекарственным препаратам, полученным из базидиальных грибов в качестве природного сырья. Они являются безопасными, высокоэффективными биосовместимыми, содержат фенолные соединения, белки, флавоноиды, полисахариды (ланофил, β-глюкан, хитин, хитозан) [1,2]. β-глюканы являются ветвящимися биополимерами, которые по структуре состоят из остатков D-глюкопиранозы. Полисахаридный состав грибов состоит в основном из глюкозы, фруктозы, ксилозы, маннозы и арабинозы, которые связываются между собой через β- (1,3/1,6) гликозидные связи. β-глюканы в них различаются по типу разветвления макромолекулярной цепи (β- (1,3/1,6)), степени и молекулярной массе [3]. Общая структура состоит и цепей β- (1,3), (1,6)–глюканов Установлено, что полисахариды, выделенные из таких видов грибов, как Ganoderma lucidum, Laetiporus sulphureus, Trametes versicolor, Polyporus umbellatus, Inonotus obliquus и Wolfiporia cocos, обладают противоопухолевым и иммуномодулирующим действием [4,5]. Кроме того, установлено, что экстракты грибов проявляют противовирусную, гепатопротекторную, антибактериальную, гиполипидемическую, адаптогенную активность [6]. Тот факт, что полисахариды имеют более сложную и изменчивую структуру, чем другие биополимеры (белки и нуклеиновые кислоты), вызывает трудности в определении связи между их структурой и биологическими факторами. Из некоторых видов диомицетов были получены противоопухолевые препараты и биологически активные добавки, в том числе Фламмулин, Ламптероп, Кальвацин, Лентинан, Крестин, Гризофиллан [1,5]. Эти лекарственные препараты в основном состоят из суммы полисахаридов, полифенолов и пептидов, и до сих пор продолжается изучение основных структур, обусловливающих их биологическую активность. Изучение полисахаридных структур грибов имеет важное значение для определения их терапевтической эффективности, взаимосвязи биологической активности и структуры, а также механизмов их действия.

Целью данной исследовательской работы является определение оптимальных условий процесса выделения водорастворимых полисахаридов из местного базидиального гриба Inonotus hp. и их предварительный скрининг на антиоксидантной активности.

Материалы и методы. Материалом для данного исследования являются грибы Innonotus Hispidus, произрастающие на тутовых деревьях были собраны на плантациях, принадлежащих Ташкентскому научно-исследовательскому институту шелководства Республики Узбекистан.

Очистка сырья. Плодовое тело базидиомицета, высушенного в печи, измельчали в лабораторном измельчителе до размера частиц от 2 до 5 мм. Для удаления низкомолекулярных примесей и белков сырье базидиомицета экстрагировали на аппарате Сокслета смесью хлороформ - этиловый спирт 95% (1: 2) с бесцветным раствором до полного завершения. Полученный экстракт выпаривали при температуре 50–60°C до густой массы, затем сушили при температуре 100 °C до остаточной влажности 5%.

Выделение водорастворимых полисахаридов. При выделении водорастворимых полисахаридов использовали метод, использованный А.П.Коржем [7], в котором изучалось влияние степени измельчения сырья, времени экстракции, соотношения экстрагента и сырья на выход экстрактивных веществ.

Определение общего количества сахара. Фенол проводили сернокислотным методом. В раствор полисахарида (0,5 мл) добавляли 5% раствор фенола (0,5 мл) и консовую серную кислоту (2,5 мл) и помещали в водяную ванну на 10 минут. При этом калибровочная кривая была построена по растворам глюкозы 10-120 мкг/мл. Исследования проводились на спектрофотометре Shimadzu UV-VIS 1280 (Shimadzu Europa GmbH, Германия) при длине волны 490 нм.

Определение величин молекулярной массы полисахаридов. Исследования проводились на гелевом хроматографе, оснащенном рефрактометрическим детектором Agilent 1260 Infiniti, хроматографической колонкой PL aquagel OH Mixed (Waters USA) 7,5 х 300 мм. Концентрация и объем вводимого образца составили 2 мг/мл и 10 мкл соответственно. В качестве элюента использовали 0,1 М раствора нитрата натрия. Скорость прохождения элюента 0,8 мл/мин. Колонки калибровались по стандартам декстран сульфата (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Германия)

Изучение полисахаридов методом бумажной хроматографии. Выделенные образцы полисахаридов гидролизовали в 1,0 н растворе N2 SO4 при температуре 100°С в течение 8 часов и определяли состав моносахаридов методом бумажной хроматографии (БХ). Выделение моносахаридов проводили на бумаге фильтрака ФН-12 (Германия) и в качестве растворителя использовали смесь бутанол: пиридин: вода (6:4:3 объема). В качестве красящего реагента моносахаридов использовали анилиновую фталевую кислоту и дифениламино-анилин.

ИК-спектроскопия. ИК-спектроскопические исследования проводились на ИК-спектрометре IR Tracer-100 (Shimadzu) в диапазоне поглощения 350-4000 см-1.

Определение острой токсичности. При оценке острой токсичности исследуемых образцов путем интрагастрального введения, в соответствии с OECD (2002), Test No. 420: Acute Oral Toxicity - Fixed Dose Procedure, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals,Section 4, OECD Publishing, Paris, https://doi.org/10.1787/9789264070943-en проводится поэтапное введение в группу однополых животных строго фиксированных доз 5, 50, 300 и 2000 мг/кг. В эксперименте исследования по определению острой токсичности проводились на фракциях ВРП-1 и ВРП-2, состоящих из полисахаридов. Эксперименты проводились на беспородных белых лабораторных мышах мужского пола массой тела 20±2,0 г. В эксперименте для каждой группы было взято по 5 мышей, и их общее количество составило 25. Фармакологические исследования проводились на здоровых половозрелых мышах, прошедших карантинный период 10-14 дней.

Изучение антирадикальной активности полисахаридов-бетаглюканов, полученных из сырья базидиомицета Inonotus Hispidus. Для оценки АРФ нами был использован спектрофотометрический метод (спектрофотометр UV-5100) для измерения кинетики уменьшения молекулы стабильного радикала 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (ДФПГ) антиоксидантами. Испытательные смеси растворяли в воде в концентрации 1 мг/мл

При добавлении исследуемых соединений в спиртовый раствор ДФПГ свободнорадикальные молекулы превращаются в нерадикальную форму, а интенсивный фиолетовый раствор ДФПГ становится бесцветным.

Результаты и их обсуждение

Для предварительной очистки сырья измельченное плодовое тело гриба экстрагировали смолоочистительным реагентом, что привело к инактивации ферментов, расщепляющих полисахариды, а также к удалению липидов, частично белков, моно-и олигосахаридов, красителей и неорганических примесей и выход составил 3,2%. После обезжиривания сырья для выделения водорастворимых полисахаридов растительное вещество последовательно экстрагировали водой и осаждали этиловым спиртом. Выход полисахарида составил 9,44%

Экстрагированные полисахариды являются порошками светло-коричневого цвета, хорошо растворимы в воде, при низких концентрациях образуют непрозрачный раствор и при высоких концентрациях образуют вязкий раствор. После этого количественное определение углеводного состава выделенных полисахаридов проводили фенольно-сернокислотным методом при максимальном поглощении длин волн 480-490 нм. Общее содержание углеводов составило 42%, что означает наличие примесей в составе экстрагированного полисахарида.

Распределение молекулярного веса и молекулярного веса определяли с помощью эксклюзионной жидкостной хроматографии. Молекулярная масса полученных образцов полисахаридов ВРП-1 и ВРП-2 составила 26,7 кДа и 14,2 кДа, а индекс полидисперсности – 1,3 и 1,6 соответственно.

В ИК спектре полученного образца наблюдались полосы поглощения, соответствующие полисахаридам при 3430, 2920, 1630, 1420-1380, 1200-750 см-1 (рис. 1). Зоны поглощения валентных колебаний O - H и C - H также наблюдались в областях 3430 и 2920 см-1, соответственно. В областях 1630 и 1420-1380 см-1 наблюдались полосы поглощения, соответствующие полисахаридам. В области 1200-950 см-1 наблюдались зоны поглощения колебаний растяжения, соответствующие связям СО и С-С. Наибольшие сведения о строении полисахарида основаны на близкой области ИК спектра (аномерной области), наличии связей, характеризующих направление и тип связи в макромолекуле полимера, а также конформационных и конфигурационных свойств. Структурные различия полисахаридов в этой области очень очевидны. Следовательно, спектр полисахарида имеет диапазон 898-900 см1.

Рисунок 1. ИК спектр водорастворимых полисахаридов, извлеченных из сырья гриба I. Hispidus

Гелевую хроматографию на Sephadex G-75 проводили для определения однородности исходного полисахарида, а также для очистки от содержащихся в нем примесей для более глубокого изучения его состава и структуры углеводных цепей. В процессе разделения было обнаружено, что образец полисахарида состоит из однородных полисахаридов (рис. 2). При этом содержание углеводов в очищенном образце полисахарида составило 99,4%. Дальнейшие исследования были направлены на определение моносахаридного состава полученного образца. Изучен моносахаридный состав полисахарида водного экстракта I. hispidus методом ГХ-МС алдитилового ацетата. Определен моносахаридный состав полисахаридов. Согласно этому, полисахариды фруктоза составляет 6,68% или 1,79 моль, рамноза - 3,37% или 1,0 моль, глюкоза - 89,58% или 89,58 моль. Как видно из полученных результатов, полисахарид состоит в основном из остатков глюкозы (рис. 3). Другие моносахариды были обнаружены в незначительном количестве в образцах и поэтому не были включены в основную структуру.

Рисунок 2. Гелевая хроматограмма водорастворимых полисахаридов базидиомицета I. hispidus

Рисунок 3. ГХ/МС спектры алдитиловых ацетатпроизводных стандартных моносахаридов, а также моносахаридов полисахарида базидиомицетной экстракции I.hispidus

При оценке острой токсичности исследуемых образцов проводили однократным внутрижелудочным введением в дозах 300 и 2000 мг/кг на беспородных белых лабораторных мышах. Животным контрольной группы вводили равный объем очищенной воды.

На основании полученных результатов установлено, что средняя летальная доза при введении в желудок испытуемого и стандартого вещества, содержащих полисахариды, составила - 300 мг/кг < LD50 <2000 мг/кг.

В течение всего исследования (14 дней) по изученным показателям: изменения ворсин, кожного покрова, массы тела, каловых масс были в норме при всех дозах препарата. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Показатели острой интоксикации при введении в желудок испытуемого и стандартного вещества, содержащих полисахариды, n=5

Была изучена антирадикальная активность (АРФ) соединений ВРП-1 и ВРП-2 по отношению к стабильному свободному радикалу ДФПГ (2,2-дифенил-1-пикрилгидразил). Вещества ВРП-1 и ВРП-2 представляют собой бетаглюкановые полисахариды, выделенные из базидиомицета Inonotus Hispidus семейства Hymenochaetaceae, произрастающего на тутовых деревьях Узбекистана (табл.2)

Таблица 2.

Строение и свойства полисахаридов - бетаглюканов испытуемого и стандарного вещества

На рис. 4 показана кинетика изменения оптической плотности раствора ДФПГ с добавлением ВРП-1 и ВРП-2.

Рисунок 4. Изменение оптической плотности спиртового раствора ДФПГ во времени при добавлении пробного соединения по сравнению с контролем. Черная толстая линия основана на нелинейной регрессии. Концентрация ДФПГ составляет 0,1 мМ. Измерения проводили сразу после добавления исследуемого препарата при 20°С. Исходная концентрация пробного соединения составила 1 мг/мл.

Как видно из экспериментальных данных, исследуемое соединение обладает способностью к гашению свободных радикалов. Для определения антирадикальной активности нами использовали стабильный радикал 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (ДФПГ), а также t 50 - время, необходимое для снижения исходной концентрации радикала исследуемых препаратов на 50% и параметр IC 50 - параметры концентрации вещества, необходимое для снижения исходной концентрации радикала на 50%. Результаты представлены в таблице 3.

Анализ экспериментальных результатов, полученных при изучении испытуемого и стандартного вещества, показал, что испытуемое вещество обладает более высоким АРФ по сравнению со свободным радикалом ДФПГ.

Таблица 3.

Время необходимое для снижения концентрации ДФПГ на 50% (t 50) при взаимодействии с 50% ингибирующей концентрацией (IC 50) и испытуемым веществом ВРП-1

Заключение

Из базидиомицетов Inonotus hispidus (семейства Hymenochaetaceae), произрастающих на тутовых и других деревьях Узбекистана, были выделены водорастворимые полисахариды и изучены их состав и физико-химические свойства. Водорастворимые полисахариды были выделены путем последовательного извлечения воды из базидиомицетного сырья и выход составил 9,44%. Полисахариды были разделены на нейтральные фракции и очищены от белков и пептидов с помощью ионообменной хроматографии. В процессе разделения было обнаружено, что образец полисахарида состоит из однородных полисахаридов. ИК-спектроскопически показано, что в спектре полисахаридов имеется диапазон 898-900 см-1, а также наличие гликозидной (β- (1,3) / (1,6)) связи β-типа.

Установлено, что моносахаридный состав полисахарида следующий: фруктоза 6,68%, рамноза 3,37% и глюкоза 89,58%. В ИК-спектроскопии показано, что в спектре полисахаридов имеется диапазон 898-900 см-1 и присутствует гликозидная связь β-типа (β- (1,3) / (1,6)).

При оценке острой токсичности исследуемых образцов в дозах 300 и 2000 мг/кг на беспородных белых лабораторных мышах установлено, что средняя летальная доза при введении в желудок испытуемого и стандартого вещества, содержащих полисахариды, составила - 300 мг/кг < LD50 <2000 мг/кг.

Анализ экспериментальных результатов, полученных при изучении испытуемого и стандартного вещества, показал, что испытуемые водорастворимые полисахариды обладают более высоким АРФ по сравнению со свободным радикалом ДФПГ. Представляются важным изучение возможности коррекции нарушений, возникающих у онкологических больных и рассматривать как перспективного противоопухолевого препарата.

Список литературы

1. Герасименя В.П., Гумаргалиева К.З., Захаров С.В.,Милевич Т.И., Трезвова А.В. Экстракты базидиальных грибов и их полифункциональная медико-биологическая активность. Монография. Москва 2014. 128 с.
2. Косогова Т. А. Штаммы базидиальных грибов юга западной Сибири – перспективные продуценты биологически активных препаратов. Автореферат. Кольцово – 2013. 25 с.
3. Zjawiony J. Biolocally active compounds from Aphillphorales (Popypore) fungi // J. Nat. Prod.-2004.-V. 67- №2. –P. 300- 310.
4. А.Ю. Айрапетова, Г.С. Гутенева. Изучение влияния фракции полисахаридов из трутовика лекарственного на гуморальный иммунитет у животных. Известия Самарского научного центра Российской академии наук, том 16, №5(2), 2014.
5. Мiles Рh.G., Сhang S.Т. Mushroom biology. Concise basics and сurrеnt developments // World Scientific, Singapore, New Jersey, London, Hong Кong, -1997. – 194 р.
6. Zhang Y., Kong H., Fang Y., Nishinari K., Phillips G.O. 2013. Schizophyllan: a review on its structure, properties, bioactivities and recent developments. Bioact Carbohydr Diet Fibre. 1(1):53–71.
7. А.П. Корж, А.М. Гурьев, М.В. Белоусов, М.С. Юсубов. Химический состав водорастворимых полисахаридов из травы Клевера лугового (Trifolium pretense L). Химия растительного сырья, 2011.№1.С.47-50.