Исследование способности активных культур микроорганизмов усваивать загрязнения нефтяного происхождения

АННОТАЦИЯ

В статье предложена экспериментальная установка, имитирующая резервуар для хранения нефтепродуктов в условиях сельского хозяйства, где проведены исследования при периодическом культивировании микроорганизмов, проверены на активность роста и степень утилизации углеводородсодержащих соединений нескольких штаммов микроорганизмов. Представлены результаты исследований по определению зависимости потребления субстрата и роста биомассы от продолжительности процесса.

ABSTRACT

Тhe article proposes an experimental setup that provides the accumulation of petroleum products in agriculture, where studies are carried out with the periodic growth of microorganisms, checking the activity and degree of use of hydrocarbon-containing compounds of several strains of microorganisms. The results of studies to determine the dependence of substrate and biomass consumption on the duration of the process are presented.

Ключевые слова: микроорганизмы, культуральная  среда, активность, биомасса, степень утилизации, субстрат, экспериментальная установка.

Keywords: Microorganisms, culture medium, activity, biomass, degree of utilization, substrate, experimental setup.

Введение. Данные  об указанной способности микроорганизмов обычно получают на небольших лабораторных установках. Это позволяет выбрать активный штамм микроорганизма, изучить его физиологические свойства и применить в дальнейшем в опытных условиях на отработанных для него режимах ферментации, которые являются оптимальными для данного микроорганизма.

Актуальность. Известные способы очистки технических объектов от остатков нефтепродуктов с применением существующих средств довольно энергоемки и недостаточно совершены. Кроме того, отработанные моющие растворы плохо регенерируются и медленно окисляются в биосфере, а вывоз их на свалку (или слив в водоемы) приносит огромный вред окружающие среде. Поэтому поиск новых способов очистки является весьма актуальной задачей.

Цель и задачи. Целью данной работы является  обосновать возможность биологической очистки технических объектов от загрязнений нефтяного происхождения.

Задача работы является определить способность ранее выбранных активных микроорганизмов  усваивать остатки нефтепродуктов на экспериментальной установке.

Материалы и методы. Исходя из этих соображений, нами была изготовлена экспериментальная установка по типу резервуара для хранения нефтепродуктов. Основной частью установки является резервуар, который представляет собой горизонтальный цилиндр емкостью 10 литров, изготовленный из органического стекла. В резервуар смонтированы следующие узлы: барботер (система подачи воздуха); теплообменник, сообщен силиконовыми шлагами с термостатом и служит для поддержания определенной температуры ; электроды для измерения рН среды; термометр сопротивления ; насос-дозатор для подачи в резервуар титрующих жидкостей ; вентиль для отбора проб.

Засевной материал получали в колбах на минеральной среде по прописью № 9 (ВНИИсинтезбелок, Россия ).

В качестве источника углерода использовали остатки дизельного топлива в концентрации 5 % объема, исходный состав которых предварительно был исследован ( см. ниже).

Испытания проводили при температуре, оптимальной для каждого вида микроорганизма, рН среды для дрожжей составлял 4,5…5,0  , а для бактерий- 6, 8…7,0 . Опыты проводили с добавлением поверхностно – активного вещества (ПАВ ) технического сульфоуреида в концентрации 0,05 % и без него.

В качестве источника азота использовали 20 %-ный водный раствор аммония сернокислого ( 4мл на литр культуральной среды ) и подаваемый на подтитровку  6%-ный водный раствор аммиака. Источниками фосфора и других биогенных элементов являлся набор концентрированных солей по прописи № 8 ( ВНИИсинтезбелок, Россия), в количестве 20 мл на литр культуральной  среды.

При исследованиях рабочий объем резервуара установки составлял пять литров.

Известно, что остатки нефтепродуктов при хранении осаждается на внутренних стенках резервуаров, особенно придонной их части. С целью определения пригодности биопрепаратов (микроорганизмов) для удаления остатков загрязнений с поверхности объектов использовали образцы из стали в форме усеченного цилиндра. Наружный диаметр образца соответствует внутреннему диаметру резервуара установки. Затем на подготовленные образцы (на внутренней части) наносили слой осадка нефтепродуктов и ставили их в резервуар установки.

Обсуждение, результаты, выводы. Известно, что в процессе биологической очистки микроорганизмы для своего роста используют углеводороды  из состава нефтяных загрязнений.

Рост микроорганизмов на нефтяных загрязнениях зависит от группового  углеводородного состава загрязнений. Поэтому было необходимо определить групповой углеводородный состав исследуемых загрязнений. В соответствии с принятой методикой состав образцов определяли хроматографическим методом. Результаты количественного определения углеводородов показывают, что в исследуемых загрязнениях содержаться углеводороды с длиной цепи от С₈ до С₂₇ . Последние содержат в среднем 68,7 %  н-алканов, 29,2 %  изоалканов и сравнительно небольшое количество ароматических углеводородов.

Таким образом, анализ  состава исследуемых образцов позволяет прийти к выводу о целесообразности  применения биологического способа  при очистке  технических объектов от остатков нефтепродуктов. Микроорганизмы,  окисляющие широкий спектр н-алканов (С₈…С₃₃ ) и другие классы соединений  как например, изосоединения  и ароматические углеводороды, наиболее перспективны для биологической очистки различных объектов от нефтепрдуктов.

Полученные результаты позволили применить модульные (стандартные) углеводороды аналогичного состава для изучения способности микроорганизмов утилизировать нефтепродукты.

При исследовании влияния температуры на рост выбранных культур установили , что имеется микроорганизмы, способные расти на средах с нефтепродуктами в широком диапозоне температур (26…42⁰ С), откуда следует, что биологическую очистку объектов можно произвести в регионах с различными климаттческими условиями.

Ранее [1], нами было выбрано активные культуры нефтеокисляющие микроорганизмов. Нефтеокисляйющая способность некоторых активных культур была проверена на экспериментальной установке, имитирующий резервуар для хранения нефтепродуктов на нефтекомплексах агропромышленного комплекса.

Установка позволила сократить время очистки (по сравнению с результатами, полученными в колбах) с 48 часов до 24...27 часов.  Это объясняется тем, что интенсивность аэрации культуральной жидкости на экспериментальной установке значительно выше, чем в экспериментальных колбах. В результате исследования установлено, что оптимальное количество воздуха, подаваемого в резервуар установки, равно 3 л/л мин (3-м литрам на литр загрязнений в минуту); количество подаваемого воздуха ниже оптимального приводит к снижению активности культур, а больше-нецелесообразно, потому что воздух, не успевая растворяться в культуральной жидкости, уходит в атмосферу.

Приведены также исследования по определению степени утилизации углеводородов после культивирования выбранных культур на экспериментальной установке. Опыты проведены с поверхностно-активным веществом (технический сульфоуреид) в концентрации 0,05 % и без него.  Результаты исследований приведены в таблице.

Таблица 1.

 Утилизация углеводородов микроорганизмами на экспериментальной установке (исходное сырьё - дизельное топливо; концентрация углеводородов - 38,8 г/ л )

Из табл. следует, что с добавлением ПАВ в культуральную среду степень утилизации углеводородов несколько увеличивается у штамма ВСБ-638 на 6,2 %, у штамма ВСБ-935 – на 2,1 %, а у штамма ВСБ-160 не изменяется. Это объясняется тем, что при интенсивной аэрации культуральной жидкости диспергирующая способность ПАВ незначительна, откуда следует, что процесс очистки может осуществляться без добавки ПАВ.

Необходимо отметить, что во всех опытах удалось слить культуральную жидкость без нефтяной эмульсии. На поверхности металлических образцев не было следов нефтепродуктов, если не считать незначительную часть биомассы, которая легко удаляется струей воды.

Из полученные микрофотографии клеток дрожжей рода Candida tropicalis ВСБ-935 в первые часы и в конце процесса ферментации (увеличение 1_*1350 в световом микроскопе МБИ-15) ) было видно, что частицы дизельного топлива полностью окислены микроорганизмами.

Результаты исследований по определению зависимости потребления субстрата и роста биомассы от продолжительности процесса представлены на рис. 1 (при воздействии штамма ВСБ-935).

Рисунок 1. Кривые роста биомассы (1) штамма ВСБ -935 и потребления субстрата (2) во времени (дизельное топливо 10 г/ л)

Рост культуры микроорганизмов во времени подчиняется определенной закономерности, которую обычно устанавливают следующим образом: в питательную среду вносят некоторое количество культуры микроорганизмов и через равные интервалы времени определяют рост клеток. В течение опыта питательные вещества в среду не добавляют и продукты обмена клеток не удаляют [2,3]. На рис. 2 представлена классическая кривая роста периодической культуры.

Кривая 1 описывает рост культуры во времени и состоит из нескольких участков (фаз развития).

Кривая 2 характеризует процесс потребления клетками субстрат S.

Рисунок 2. Кривые роста периодической культуры:

1 - рост культуры во времени; 2 – кривая потребления субстрата.

I- начальная или лаг- фаза; II-фаза логарифмического роста; III - фаза замедления роста; IV- стационарная фаза роста; V- фаза отмирания клетки.

Сопоставление рис.1 и рис. 2 показывает, что экспериментальные данные вполне удовлетворительно согласуются с результатами теоретических исследований.

Таким образом, полученные результаты исследований служат основой создания технологии биологической очистки технических объектов от нефтяных загрязнений.

Список литературы:
1. Хамроев О. Ж. Исследования способности микроорганизмов диспергировать нефтепродукты // Наука, техника и образование, 2020. № 4(68).
2. Чурбанова И. Н. Микробиология. – М. : Высшая школа, 1987. -239 с. , ил.
3. Шлегель Г. Общая микробиология: Пер. с нем.– М.: Мир,1987. – 567 с., ил.