ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ПРИ ОБНАРУЖЕНИИ АНТИТЕЛ К ВИРУСНОМУ ГЕПАТИТУ С

АННОТАЦИЯ

Хронический гепатит С (ХГС) представляет серьезную угрозу для глобального здоровья, поскольку он является основной причиной развития гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) и ведущим показанием для трансплантации печени. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), во всем мире 130-150 миллионов человек страдают ХГС, что приводит к 350-500 тысячам смертей ежегодно. Ранняя диагностика ХГС имеет решающее значение для своевременного лечения и предотвращения неблагоприятных последствий. Иммуноферментный анализ (ИФА) является широко используемым методом для выявления антител к вирусу гепатита С (ВГС) в клинических лабораториях. ИФА обеспечивает высокую чувствительность и специфичность, что позволяет точно диагностировать ХГС. Разработка эффективных методов ИФА для обнаружения антител к ВГС является важной задачей для совершенствования диагностики ХГС. В этой статье обсуждаются современные достижения в разработке методов ИФА. Усовершенствованные методы ИФА позволили улучшить чувствительность и специфичность диагностики ХГС, что привело к более точным результатам тестирования и своевременной постановке диагноза.

ABSTRACT

Chronic hepatitis C (CHC) is a serious global health threat because it is the main cause of hepatocellular carcinoma (HCC) and it is also the main reason for liver transplantation. As stated by the World Health Organization (WHO), 130–150 million people worldwide are living with CHC, which brings 350,000–500,000 deaths every year. The early detection of CHC is of great importance as it helps in the prompt treatment and avoidance of negative consequences. Enzyme immunoassay (EIA) is a method that is extensively used for the detection of antibodies against hepatitis C virus (HCV) in clinical laboratories. EIA enables the identification of CHC with a high degree of sensitivity and specificity, thus, it can be used for the accurate diagnosis of CHC. The creation of the effective EIA methods for HCV antibody detection is a very significant research area which is aimed to increase the CHC diagnostics. This article presents the recent progress in the development of EIA assay, such as the application of synthetic peptides and recombinant antigens, the optimization of EIA conditions, and the automation of the process. The new EIA methods have improved the sensitivity and specificity in CHC diagnostics, thus the test results and the diagnosis are more accurate and the patient is diagnosed in a timely manner. This contributes much to the improvement of treatment results and decreasing the load of CHC-related diseases.

Ключевые слова: иммуноферментный анализ (ИФА), антитела, вирус, гепатит, ВОЗ.

Keywords: enzyme immunoassay (EIA), antibodies, virus, hepatitis, WHO.

Введение.

Вирусный гепатит С относится к числу распространенных заболеваний. В структуре инфекционной патологии вирусные гепатиты составляют 16–30%, а по частоте поражения населения уступают лишь гриппу и острым респираторным вирусным инфекциям [1]. По данным ВОЗ, на сегодняшный день более 2 млрд человек в мире инфицированы вирусом гепатита В (ВГВ), у более 400 млн из них – хронический гепатит В (ХГВ); 130–250 млн человек инфицированы вирусом гепатита С (ВГС), у 175 млн из них – хронический гепатит С (ХГС) [2]. По данным ВОЗ, ежегодно почти 700 000 человек умирают от неблагоприятных исходов ХГС и около 1 млн человек – от исходов ХГВ [3]. По данным ВОЗ, в 2015 году смертность от ХГВ составила 887 000, а в 2017 – 786 000, в целом смертность от ХГВ стоит на 10-м месте среди всех причин смерти (глобальный отчет ВОЗ по вирусным гепатитам, 2017) [3]. Распространенность вирусного гепатита С среди населения Узбекистана составляет 13,3% [4].

В большинстве случаев острый вирусный гепатит С (ОВГС) характеризуется мало симптомным или латентным течением [5]. В связи с этим в последние годы во всем мире методы лабораторной диагностики приобретают решающее значение в постановке диагноза данного заболевания [6-8]. Для лабораторной диагностики ОВГС традиционно используются иммуноферментный анализ (ИФА), который основан на выявлении серологических маркеров инфекции, и полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяющая идентифицировать РНК вируса гепатита С (ВГC) [9]. Несмотря на то что ПЦР является высокоэффективным методом диагностики ОВГС, ее широкое использование в практическом здравоохранении ограничивается в связи с необходимостью дорогостоящего оборудования [10].

В связи с чем целью настоящей работы является повышение выявляемости вирусного гепатита С у инфицированных ВГС (генотипы 1b и 3а), упрощение процесса постановки иммуноферментного анализа и удешевление диагностических наборов для выявления антител к вирусу гепатита С иммуноферментным методом имеет важное теоретическое и практическое значение.

Материалы и методология исследования

В лабораторной диагностике и мониторинге HCV инфекции используют два основных подхода:

— серологические методы, основанные на обнаружении специфических антител к HCV (анти-HCV антител);

— молекулярно-биологические методы, основанные на обнаружении РНК вируса.

Методы анализа, основанные на обнаружении анти-HCV антител, используются как для скрининга, так и для диагностики HCV-инфекции. Специфичность современных тест-систем для иммуноферментного анализа (ИФА) анти-HCV антител превышает 99%.

Для выявления антител к вирусу гепатита С иммуноферментным методом, включающем иммобилизацию смеси рекомбинантных сердцевинных антигенов и трех неструктурных белков (NS3, NS4, NS5) вируса гепатита С, провели инкубацию контрольных и исследуемых проб с иммобилизованными рекомбинантными антигенами, отмывали несвязанные компоненты, все пробы буферного раствора с антителами, конъюгированными пероксидазой, отмывали, добавляли субстрат с красителем, добавляя раствор серной кислоты анализировали все пробы с помощью фотометрии. При этом для иммобилизации смеси рекомбинантных сердцевинных антигенов и трех неструктурных белков дополнительно использовали антигены NS3-C HCV генотипа 3а (а.а. 1189-1465), NS4a+b (а.а.1689-1735) и NS5 HCV генотипа 1b, которые предварительно разводили в 50мМ растворе карбонат-бикарбонатного буфера (рН 9,5-9,7) с 8 М мочевины десятикратно. После иммобилизации вышеуказанных антигенов и неструктурных белков сорбент обрабатывали буферным раствором, содержащим 0,175% сухого обезжиренного молока и 5% сахарозы, при этом в качестве проявляющего буферного раствора использовали однокомпонентный субстратный раствор, содержащий 0,005% тетраметилбензидина и 0,006% Н₂О₂, с рН 3,3.

Результаты и их обсуждение

Принцип анализа для обнаружения антител к вирусному гепатиту С основан на методе непрямого твердофазного иммуноферментного анализа. При измерении оптической плотности смеси в лунках при длине волны 450-620 нм определяли критическую оптическую плотность (ОПкр), добавлением к средней оптической плотности отрицательного контрольного образца ОН Кср константной величины 0,15:

ОПкр=ОП К^- + 0,15.

При этом исследуемые образцы с оптической плотностью выше ОПкр учитывались как положительные. Исследуемые образцы с оптической плотностью ниже ОПкр учитывались как отрицательные. Некоторые полученные данные приведены в 1-таблице.

Таблица 1

Сравнительные результаты иммуноферментного анализа на полистироловом сорбенте антигенами ВГС, иммобилизованными при нейтральном трис-буфере рН 7,2( по наиболее близкому аналогу - НБА) и с предварительным 10-кратным разведением в 50мМ карбонат-бикарбонатном буферном растворе с 8 (VI мочевины (по предлагаемому способу).

Приведенные в таб.1 результаты иллюстрируют значительное улучшение специфичности при иммобилизации антигенов по предлагаемому способу, что способствует снижению вероятности получения ложноположительных результатов при исследованиях пациентов на наличие в крови антител к ВГС.

По результатам проведенных исследований, качественные характеристики способа (по предлагаемому) составили:

- чувствительность 100%;

- специфичность 100%.

Следует отметить, что такие высокие качественные характеристики обусловлены применением заявленного способа, который является неочевидным оригинальным и работает в совокупности существенных отличий. Он включает в себя выбор иммобилизуемых белков-антигенов определенных генотипов, специфичных для региона Центральной Азии, и в сочетании с последующими операциями позволяет производить конкурентоспособную тест-систему для диагностики вирусного гепатита С в промышленном масштабе.

Заключение

1. Цена 100 г бычьего сывороточного альбумина (БСА) составляет 80-200€, а цена 1000 г сухого обезжиренного молока составляет 2,1-2,5€. Из представленных данных можно сделать вывод, что для промышленного производства иммуноферментных тест-систем применение буфера, содержащего 0.175% сухого обезжиренного молока и 5% сахарозы, является оптимальным и более экономичным.

2. Производимая в Государственном предприятии «РАДИОПРЕПАРАТ» диагностическая тест-система отвечает всем требованиям Фармакопейного комитета и Министерства Здравоохранения и является надежной, востребованной, доступной по цене и необходимой в рамках стратегии импорт замещения, проводимой правительством Республики Узбекистан.

Список литературы:

1. Ющук Н.Д., Климова Е.А., Знойко О.О. и др. // Рос. журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии – 2010. –№6. –С.4–60.
2. Centers for Disease Control and Prevention. Viral hepatitis surveillance. – United States, 2017. Atlanta: US Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention.  – 2019. – Available at: https://www.cdc.gov/hepatitis/ statistics/2017surveillance/index.htm.
3. World Health Organization. World Hepatitis Report. – Geneva, 2017. Available at: https://apps.who.int/iris/bitstream/hand le/10665/255016/9789241565455-eng.pdf;jsessionid =10847CB8AB36884692B8BEBBD0D54EB5?seque nce=1,accessedAug17,2020.
4. Ruzibakiev R., Kato H., Ueda R. et al. Risk factors and seroprevalence of hepatitis В virus, hepatitis C virus, and human immunodeficiency vims infection in Uzbekistan. Intervirology. 2001,44 (6): 327-332.
5. Гепатиты: рациональная диагностика и терапия; под ред. М. Фукса; пер. с нем. под ред. А. О. Буеверова. М.: ГЭОТАР-Медиа 2010; 235.
6. Кишкун А. А. Иммунологические и серологические исследования в клинической практике. М.: МИА 2006; 536.
7. Круглов И. В., Огиенко О. Л., Знойко О. О., Финогенова М. П., Янина М. В., Дорошенко Н. В., Шибнев В. А., Семилетов Ю. А. Исследование сеpоконвеpсии к pазличным антигенам виpуса гепатита С у больных гепатитом С с pазличными исходами. Вопросы вирусологии. 2003; 2: 36–40.
8. Круглов И. В., Знойко О.О., Климова Е. А., Финогенова М. П., Алексеенкова Т. И., Янина М. В., Воропаева А.В., Воропаев Е. В., Калинин А. Л., Дорошенко Н. В., Шибнев В. А., Семилетов Ю. А. Выявление типоспецифических анти-HCNS4-антител у больных гепатитом С методом иммунофеpментного анализа. Вопросы вирусологии 2003; 3: 32–36.
9. О применении некоторых статистических методов в иммунологических исследованиях: инструктивное письмо № 345 Института иммунологии ФМБА от 15.07.2005. М. 2005; 35.
10. ПЦР в реальном времени; под общ. ред. Д. В. Ребрикова. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний 2009; 223.
11. Афанасьев А. Ю., Зубов С. В., Жданов Ю. Е., Кривопускова А. В. ИФА-диагностика в разграничении гепатита С острого и хронического течения. Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2005; (5) 3; прил. 1: 12.