Некоторые свойства протеолитических ферментов гриба Aspergillus oryzae - 5

АННОТАЦИЯ

В статье приводится данные по изучение протеолитической активности микроскопического гриба Aspergillus oryzae-5 на среде с мукой и пшеничными отрубями, с включением минерадьных солей в динамике роста в течение 24-144 часов культивирования. Обнаружено, что гриб в оптимизированных глубинных условиях среды образует протеолитические ферменты, проявляющие активности в различных значениях рН-среды. Выявлено, что образуемый фермент проявляет высокую активность в различных значениях (рН-2,5, рН-5,5, рН-7,2 и рН-9,0).  Полученные данные открывают новые возможности использования протеолитических ферментов гриба Aspergillus oryzae-5 в фармацевтической отрасли и промышленности, где требуются протеазы со стабильностью к кислым и щелочным условиям процесса.

АBSTRACT

The article provides data on the study of the proteolytic activity of the microscopic fungus Aspergillus oryzae-5 on a medium with flour and wheat bran, with the inclusion of mineral salts in the dynamics of growth during 24-144 hours of cultivation. It was found that the fungus, in optimized submerged conditions of the environment, forms proteolytic enzymes that exhibit activities at various pH values. It was revealed that the formed enzyme exhibits high activity in various values ​​of рН (pH-2.5, pH-5.5, pH-7.2 and pH-9.0). The obtained data open up new possibilities for the use of proteolytic enzymes of the fungus Aspergillus oryzae-5 in the pharmaceutical industry and industry, where proteases with stability to acid and alkaline process conditions are required.

Ключевые слова: гриб, Aspergillus oryzae-5, культивирование, динамика, протеаза, стабильность, активность, значение рН, свойства, оптимальные параметры.

Keywords: fungus, Aspergillus oryzae-5, cultivation, dynamics, protease, stability, activity, pH- value, properties, optimal parameters.

Введение. Известно что, в последнее время широко используются ферменты и ферментные композиции во многих отраслях народного хозяйства, в современных биохимических анализах, клинической диагностике, анализе токсических веществ, иммуноферментных реакциях, и особенно в составе лечебных препаратов различных заболеваний пищеварительного тракта, ожогах, гнойных заболеваниях, посттравматических и пост хирургических осложнениях ит.д. Энзимопрепараты и их композиции успешно применяются при создании различных диетических продуктов питания детского и взрослого назначения  [1]

Основные промышленные микроорганизмы для производства ферментных препаратов — это микроскопические грибы родов Aspergillus, Rhizopus, Penicillium и другие, а также бактерии рода Bacillus и актиномицеты, которые являются активными продуцентами амилолитических, протеолитических, пектолитических и других ферментов [2]. Среди микроорганизмов, плесневые грибы имеют особое место, так как они очень широко распространены в природе; основное место их обитания — почва. Несмотря на наличие многих ро­дов и видов плесневых грибов, все они характеризуются нитевидным строением тела и специфическим строением плодоносящих органов, высокой проникающей способностью в нерастворимый субстрат. Гифы распространяются по поверхности питательного субстрата, образуя мицелий и частично врастают в него, деструтирует, образуя соответствующие ферменты [3]

Среди микромицетов, аспергиллы являются типичными аэрофилами, поэтому они мо­гут развиваться только на поверхности твердой или жидкой среды, достаточно аэрируемой среде. Оптимальная темпера­тура для, большинства аспергиллов 25-30°С, для некоторых - до 35°С. Большинство грибов при поверхностном культивировании мо­гут переносить кратковременное повышение температуры до 40 и даже 45°С без заметной потери активности ферментов. Оптималь­ная влажность среды для них около 65%  [5,6]

Множества грибы рода Aspergillus образуют гидролитические ферменты, особенно протеолитически активные белки, имеющие очень ценное промышленное значение. Протеазы (КФ.-3.4.1.) относятся к промышленно важным ферментам, которые успешно используются в пищевой, фармацевтической и во многих отраслях производства.В связи с этим, ферментативный гидролиз белоксодержащих субстратов различного происхождения (растений, животных и их белоксодержащих отходов) до составляющих их аминокислот и их смесей все ещё остаётся важнейшим направлением исследований в биотехнологии, где для усовершенствования биотехнологических процессов необходим поиск высокоактивных протеолитических и сопутствующих им ферментов, особенно тогда, когда используются помолы злаковых и зернобобовых культур, содержащих в своём составе помимо белков высокое содержание крахмала, целлюлоза, гемицеллюлоза, пектин и др. [4]. Использования животных белков, гидролизатов, мясных фаршов и их разновидновостей, а также пшеничного, кукурузного помола нашли широкое применение в некоторых областях пищевой промышленности Республики Узбекистан, таких как мясо-молочная, кожевенная, фармацевтическая, спиртовая, крахмало-паточная, пивоваренная, где их можно было с успехом применять и в текстильной и в целлюлозно-бумажной и химической промышленности [9].

Особый интерес к протеазам вызвано тем, что они оказывают существенное влияния на активности сопутствующих им ферментов, в частности а-амилазы при производстве этанола в промышленности. Причиной тому является то, что они могут ингибировать действия амилаз и др.ферментов, приводя к частичному, но и также по высокой своей активностью к полному протеолизу. С другой стороны они гидролизуют белки на аминокислоты, которые в дальнейшем могут быть употреблены дрожжами во время брожения, что приводит к сокращению сроков брожения и концентрацию азотсодержащих реагентов для культур маточных дрожжей. Тогда как некоторая часть этих расшепленных аминокислот могут служить основой биосинтеза сивушных, т.е. высших спиртов, которые оказывают негативное влияние на качества спирта и производительность заводов [9].. Поэтому, изучение протеаз и увеличение их активности в комплексном препарате амилаз для производства и в фармацевтической отрасли по пути создания лекарственных средств против болезней желудочно - кишечного тракта и др. всегда привлекает пристальное внимание ученых и производственников.

При определении цели данной работы нами было обращено внимание на некоторые факторы, диктующиеся от происхождения протеолитических ферментов и их природы. В частности, пищеварительный фермент пепсин является ферментом животного происхождения, отличающиеся целым рядом свойств, но получение которого является зависимым от поставки сычуга животных, относятся к кислым протеазам и получение его является дорогоовизной.

Следовательно, изыскания микробных продуцентов образующиеся протеазы подобно пепсину является очень актуальной и высокоэффективным направлением как в энзимологии, так и в биотехнологии. 

Исходя из вышесказанного, целью настоящего исследования явилось изучение компонентного состава протеазы в зависимости от рН –реакционной смеси, образуемой в культуральной жидкости (КЖ) гриба Aspergillus oryzae., а также изучение оптимальных условий ферментообразования и физические свойства  образующихся  ферментов в динамике роста гриба.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Ферментационная питательная среда для скрининга. Культивирование гриба, Aspergillus oryzae-5, выделенный из картофельной мезги проводили в конических колбах емкостью 750 мл одержащей 250 мл жидкой питательной среды (3 % отруби, 2 % мука, макро и микроэлементы в концентрациях 0,05-0,5 %,  на качалке при 240 об/мин. при температуре 32°С в течении 24-144 часов.

Определение протеазной активности. Определение протеолитической активности осуществляли по (модифицированному методу Ансона) и ГОСТу – 20264.2-88.[8]

За единицу протеолитической активности приняли способность фермента превращать за 1 мин при температуре 30°С казеинат натрия в неосаждаемое трихлоруксусной кислотой состояние, в количестве, соответствующим 1 мкмоль тирозина.

Определение концентрации белка. Для оценки общей суммы протеолитической активности, концентрацию белка определяли по методу Лоури [7 ]. В качестве стандартного белка использовали бычий сывороточный альбумин.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что основным критерием в деле успешного создания новых, отечественных технологий, потребители нуждаются высокоактивным штаммам, ферментов и процессов их получения, и немаловажное свойства –физическим параметром активного действия, к которым относится рН-реакционной смеси, температура метаболиты которые накапливающиеся в КЖ, остаточное концентрация субстрата в среде и др факторы, непосредственно влияющие на образование и активности ферментов.

Для этой цели нами была использована местный, экологически приуроченный штамм микроскопического гриба Aspergillus oryzae.

Известно, что в процессе культивирования повышается биомасса, количество белка и к этим параметрам параллельно повышается активность фермента.

Первоначальный качественный анализ способности гриба Aspergillus oryzae на протеолиз белков проводили с использованием 10-15 % животного белка - желатин и растительного белка - глютена на агаризованных средах на чашках Петри. Зоны гидролиза, степени разжижения субстратов и осветления зоны вокруг колоний гриба в течение48-144 часов. показали гидролизующую способность культуры. .

Исследования физических свойств протеазы, образуемой в КЖ гриба в течение 120 часов показали, что гриб Aspergillus oryzae образует  проеолитические ферменты, активности которых зависит от времени культивирования и рН-реакционной смеси.

Полученные результаты показали, что гриб Aspergillus oryzae-5 обладает   способностью накапливать в среде культивирования протеолитические ферменты, обладающие широким спектром катализа в различных диапазонах рН реакционной смеси.

Обнаружено, что гриб Aspergillus oryzae-5 образует протеазы, действующие в кислых диапазонах рН в разной степени, что сближает их протезами животного происхождения, в частности пепсин (Рис.1).

Рисунок 1. Динамика образования кислой протеазы грибом Aspergillus oryzae-5 в условиях рН-2,5

Так например, при рН 2,5 кислая протеаза образуются начиная 72 часов роста гриба, достигая максимума к 120 часам роста, позже наблюдали резкий спад в активности данного фермента на 144 часам роста.

Рисунок 2. Динамика образования нейтральной протеазы при рН-5,5 грибом Aspergillus oryzae-5

Аналогичная картина наблюдался при выявлении протеазной активности при рН 5,5. Из рис. 2 видно, что актвность фермента начинает проявляться с 60 часов, начиная 96 часов наблюдается резкий подъем, достигающая максимума к 120 часам роста (Рис.2). В отличие от кислой протеазы, нейтральная протеаза не теряет активности в дальнейшие сроки роста, т.е. к 144 часам обнаруживали незначительный спад в проявлении активности нейтральной протеазы.

Рисунок 3. Динамика образования щелочной протеазы грибом Aspergillus oryzae-5 при рН-7,2

Что касается щелочной протеазы, то активность в данном значении рН-7,2 проявляется довольно высоко к 72 часам, достигая максимума к 96 часам роста, далее наблюдается спад активности почти на 90 % к 120 часм роста, тогда как к 144 часам обнаруживается незначительный подъем в активности фермента (Рис.3).

Весьма интересные данные были получены при исследовании активности фермента сильно щелочной среде рН- 9,0. Оказалось, что данный диапазон не оказывает негативное влияние на активность грибной протеазы, т.е. к 72 и 96 часам роста культура образует достаточное  количество щелочной протеазы.

Рисунок 4. Динамика образования сильно щелочной протеазы грибом Aspergillus oryzae-5 при рН-9,0

В проведенных выше экспериментах было обнаружено очень интересные данные, т.е. к 120 часам роста, когда остальные протеолитические активности достигает максимума, только у шелочной протеазы наблюдается резкий спад в данной периоде роста, далее активности фермента возобновляется к 144 часам роста продуцента (Рис.4).

Таким образом, изучение роста, развития и образования протеолитических ферментов, проявляющие активности в различных диапазонах рН-среды грибом Aspergillus oryzae-5 показали, что данный гриб обладает уникальным свойствам продуцировать протеазы, проявляющиеся свои активности в сильно кислой (рН- 2,5) и сильно щелочной (рН- 9,0) реакционной среде.

Эти факты имеют очень большое значение не только в понятии механизмов энзиматического катализа, но и на практике. В частности, кислая протеаза может служит истоникам создания лекарственных препаратов, употребляющих при лечении болезней желудочно-кисшечного тракта, панкреатитов, диарейных заболеваниях, язвах, ожогах.

Тогда как, щелочная протеаза можеть быть использован при создании биологических детергентов, моющих стредств и др. целебных мазей, свечи и др. продуктов, связанные с надобностью сильно щелочной среды.

Список литературы:

1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: Учебник.- М.: Медицина, 1990.- С.11
2. Билай В.И., Коваль Э.З., «Аспергиллы», Киев, Наука думка 1988, С. 123.
3. Глемжа А.А., Люджюс Л.Л., Петрова Л.И. “ Микробные ферменты в народном хозяйстве ”. Вильнюс. “ Мокслас ” 1985
4. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. – М.: Высшая школа. 1980.– С.272.
5. Морозова К.А., Грачева И.М., Римарева Л.В., Оверченко Селекция штамма A. oryzae с целью получения активного продуцента протеолитических и амилолитических ферментов // Тезисы док. Всероссийской научно-технической конференции-выставки М.: МГУПП, 2004, С. 143-145
6. Препараты ферментные, Метод определения протеолитической активности. ГОСТ 20264. 2-88, Государственный Комитет СССР по стандартам, Москва, 1988.
7. Фениксова Р.В. Плесневые грибы из рода Aspergillus как продуценты амилазы //   «Микробиология» 1966, Т. XXII вып. №1, С. 231
8. Яхяева М.А., Ахмедова З.Р.Протеолитические ферменты местного штамма гриба Aspergillus oryzae-5 и перспективы их использования. Сб. тезисов  Межд.конференции « Проблемы внедрения инновационных идей. Технологий и проектов в производство», Ташкент, 2012, С. 514-516.
9. O.H. Lowry, N.J. Rosenbrough, Farr A.L., Randell R.I. Protein measurement with Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. №1. Р. 265-275.