Влияние минеральных солей на ферментативные активности гриба Agaricus bisporius - 12

АННОТАЦИЯ

Статья посвящена изучению влияния различных минеральных солей (0,01-0,2 %) на активность некоторых гидролитических ферментов гриба Agaricus bisporius - 12. Были использованы 0,01-0,2 % растворы солей MgSO4, KCl, K₂HPO₄, NaNO_3, которые были включены в состав питательной среды, приготовленной на основе послеспиртовой пшеничной барды. Определены оптимальные концентрации минеральных солей, валяющие на активность гидролитических ферментов (целлюлаза, ксиланаза, амилаза) гриба Agaricus bisporius – 12, выращенного в подобранных оптимальных условиях. Установлено, что ионы минеральных солей и их концентрации по разному влияют на активность образуемых ферментов в культуральной среде. При концентрации MgSO4 0,10 %, ,KCl-0,05 %, K₂HPO₄, -0,10 % и NaNO₃ -0,15% наблюдается увеличение активности целлюлазы на 41,2 %, 5,6 %, 39,7 %, 37,3 % соответственно. Показано, что присутствие минеральных солей существенное влияние оказывали, прежде всего, на активность ксиланазы, достигающей до 147 % в присутствии NaNO3, далее до 71,0 % в присутствии K₂HPO_4, затем до 66 % в присутствии соли KCl, и наконец до 51 % в присутствии солей MgSO4. Особое внимание заслуживает тот факт, что активность целлюлазы на среде с KCl самая низкая, увеличение которой составила всего 5,6 %. Эксперименты показали, что каждая соль оказывал разное влияние на активность ферментов, образуемых грибом Agaricus bisporius 12 Самыми благоприятными были соли NaNO3 и K₂HPO_{4 ,} затем MgSO и наконец ионы KCl. При более большей концентрации минеральные соли действует отрицательно на накопление фермента в кльтуральной среде гриба Agaricus bisporius - 12.

ABSTRACT

The article is devoted to the study of the influence of various mineral salts (0.01-0.2%) on the activity of some hydrolytic enzymes of the fungus Agaricus bisporius - 12. 0.01-0.2% solutions of salts MgSO4, KCl, K2HPO4, NaNO3 were used, which were included in the composition of the nutrient medium prepared on the basis of distilled wheat stillage. The optimal concentrations of mineral salts affecting the activity of hydrolytic enzymes (cellulase, xylanase, amylase) of the fungus Agaricus bisporius-12, grown under the selected optimal conditions, have been determined. It has been found that the ions of mineral salts and their concentrations have different effects on the activity of the enzymes formed in the culture medium. At a concentration of MgSO4 0.10%,, KCl-0.05%, K2HPO4, -0.10% and NaNO3 -0.15%, an increase in cellulase activity is observed by 41.2%, 5.6%, 39.7%, 37.3% respectively. It was shown that the presence of mineral salts had a significant effect, first of all, on the xylanase activity, reaching up to 147% in the presence of NaNO3, then up to 71.0% in the presence of K2HPO4, then up to 66% in the presence of KCl salt, and finally up to 51% in the presence of MgSO4 salts. Particularly noteworthy is the fact that the cellulase activity in the medium with KCl is the lowest, the increase in which was only 5.6%. Experiments showed that each salt had a different effect on the activity of enzymes produced by the fungus Agaricus bisporius 12 The most favorable were salts NaNO3 and K2HPO4, then MgSO and finally KCl ions.  At a higher concentration, mineral salts have a negative effect on the accumulation of the enzyme in the culture medium of the fungus Agaricus bisporius - 12.

Ключевые слова: гриб Agaricus bisporius-12, зерновая барда, культивирование, минеральные соли, рост, ферменты, активности.

Keywords: mushroom Agaricus bisporius-12, grain stillage, cultivation, mineral salts, growth, enzymes, activities.

ВВЕДЕНИЕ. В последнее время благодаря целому ряду ценных свойств использование древоразрушающих грибов в биотехнологии имеет широкий размах, как за рубежом, так и в Республике Узбекистан, среди которых шампиньоны занимают лидирующее положение. Так, из 20 видов шампиньонов в настоящее время массивно культивируются всего 10 видов, имеющие особенные свойства, по продуктивности, качеству и ценному составу. Самым известным из них является гриб шампиньон обыкновенный Agaricus bisporius, который сравнительно недавно стал культивироваться промышленным способом повсеместно, также и в Республике Узбекистан.

Одной из главных проблем, с которой сталкиваются грибоводы, является создание оптимальных физиологических условий культивирования данных грибов для достижения высоких, стабильных и качественных плодоэлементов. Прежде всего, это касается решения проблем высокой скорости роста мицелия, устойчивости к конкурентной сопутствующей микрофлоре, повышения жизнеспособности грибного мицелия, устойчивость к болезням. Одним из приемов для получения высококачественного мицелия может быть воздействие биологических и химических агентов на процесс онтогенеза гриба [1].

Проведенный анализ обзора литературы показал, что изучению влияния различных компонентов среды, помимо источников азота и углерода, такие как витамины, минеральные вещества, фитогормоны, биорегуляторы на рост и развитие мицелия базидиальных грибов посвящено много работ [2,3]. Так, были изучены: увеличение секреции ферментов с помощью применения кинетина, ауксина, гибберелина, витаминов у бактерий и плесневых грибов . При недостатке железа в клетке гриба тормозятся окислительно-восстановительные процессы, необходимые для роста грибов, а марганец активизирует работу ферментов, катализирующих реакции цикла Кребса (дегидрогеназу, декарбоксилазу) [4,5] . В процессе дыхания грибов придается большое значение не только катионам марганца, но и меди. Реакция грибов на наличие меди в среде весьма чувствительна. Так, для конидий Pleurotus ostreatus показано, что цвет при повышении концентрации меди изменяется от белого до желто-коричневого, а рост грибов пропорционален содержанию меди [ 6.7.8].

Некоторые грибы используют органические остатки любого рода (убиквисты), но другие предпочитают совершенно определенные субстраты: например, часть Dothideaceae обитает только на растениях определенного рода или вида (специализированные сапробионты). В естественных условиях вешенка поселяется на ослабленной или мертвой древесине, относится к группе ксилотрофов (дереворазрушающих грибов) [9,10, 11].. Основным источником питания дереворазрушающих грибов является древесина. Отчасти, такая специализация зависит от того, располагает ли гриб ферментами для разложения нерастворимых источников углерода (например, крахмала, целлюлозы, лигнина) или же он способен перерабатывать только растворимые органические вещества. На здоровых деревьях, как правило, грибы, относящиеся к этой группе, не встречаются. Характерно вертикальное расположение вешенки по стволу дерева, центрическое расположение опенка на пне.

Соединения, содержащие углерод, играют основную роль в питании грибов, поскольку они участвуют как в конструктивном, так и в энергетическом процессах гетеротрофных организмов. К наиболее богатым углеродом органическим веществам принадлежат углеводы, которые при окислении способны расщепляться на более простые соединения с освобождением энергии. Утилизация источников углерода высшими базидиомицетами в основном зависит от следующих факторов: физической доступности, условий культивирования, присутствия в среде других питательных веществ, времени культивирования, адаптации штамма к субстрату [11,12,13].

Азот очень важный элемент питания для дереворазрушающих грибов. Он необходим не только для построения хитиновой клеточной стенки, но и, прежде всего, является основой белковой части протопласта, входит также в состав молекул аминокислот, белков и ферментов. Содержание его в древесине относительно небольшое, обычно 0.1-0.3 % и находится он главным образом в составе органических соединений, остатков цитоплазмы внутри пустых клеточных полостей. Азот в органических соединениях - белках и пептонах более доступен для грибов, чем азот нитратов или аммонийных солей [14.]. С увеличением азота в древесине увеличивается скорость роста грибов и интенсивность их деятельности. Основными источниками неорганического азота являются нитратные и аммонийные соли [15,16]. В. Лилли и X. Барнет также отмечали, что аммонийные соли обеспечивают лучший рост грибов, чем нитраты и аминокислоты [9]. Вместе с тем в литературе представлены данные о слабом использовании штаммами вешенки неорганических источников азота [17].

В этой связи перспективным является применение неорганических веществ, витаминов и регуляторов роста для выращивания мицелия грибов. Их действие хорошо изучено на растениях, они способны не только повысить урожайность, но и функционировать в качестве антистрессового фактора при неблагоприятных воздействиях (понижение температуры, пересевы с одной среды на другую, рост с конкурентами). В современным микологии остро стоит проблема получения качественного и конкурентного мицелия, которая может быть решена с помощью использования биологически активных веществ (БАВ). Возможно, добавление этих веществ на начальном этапе (в агаризованную среду в чашке Петри), поможет мицелиальной культуре в дальнейшем легче справляться со стрессами -пересев на твердый целлюлозосодержащий субстрат. Все это в свою очередь приведет к повышению урожайности грибов.

Наряду с источниками азота и углерода, минеральные элементы питания имеют очень большое значение в процессе роста и развития, протекании целостных метаболических процессов, приводящие к активному биосинтезу нужных элементов и питательных веществ, образованию ценных плодоэлементов и др. Минеральные вещества способствуют образованию биологически молекул, входят в активный центра множества ферментов, образуют координационные, межмолекулярные связи, гидрофильные и нужные гидрофобные участки, являются сшивающими агентами в образовании мембранных веществ, регулирует обмен (экзо и эндоцитоз) веществ, образуют пропускающие ионные каналы и обеспечивает клетки грибов нужнами питательными веществами, регулируя их количества. Выявлено, что биорегуляторы, минеральные вещества, достаточно ввести на начальном этапе приготовление грибного мицелия и их действие пролонгируются на все стадии культивирования (не только на рост мицелия вешенки, но и на последующую стадию образования плодовых тел), что сходно с действием биорегуляторов, минеральных солей на другие Basidiomycetes. На наш взгляд, их положительное влияние на рост культуры вешенки, могло быть, связано со стимуляцией ферментов лигнолитического комплекса: целлюлазы и лакказы, которые, в основном, участвуют в разложении и утилизации целлюлозосодержащих субстратов можно достичь положительных результатов по пути культивирования базидиомицетов с получением качественных плодовых тел [13.15]

Было изучено действие биорегуляторов на активность ферментов лигнолитического комплекса. В ходе проведенных экспериментов показано, что повышенный уровень активности этих ферментов является результатом воздействия стимуляторов роста на данные энзимы, и возможно, синтез молекул лакказы и целлюлазы de novo. Это предположение в определенной степени подтверждается электрофоретическими исследованиями изозимного спектра лакказы [16-18, 19,20].

Следовательно, изучение влияния макро и микроэлементов на рост и развития, образование метаболических веществ грибами, особенно базидиальными имеет большое научно-практическое значение.

В связи этим в данной работе приводятся экспериментальные данные, касающиеся изучения влияния широко употребляемых минеральных солей на рост и развитие гриба и образованию гидролитических ферментов базидиальным грибом Agaricus bisporius-12.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе использовали послеспиртовую зерновую барду, полученную из ОАО “Бектемирспирт” (Узбекистан). Ферментацию проводили с использованием местных штаммов базидиальных грибов, в частности Agaricus bisporus sp 12.

Культивирование гриба проводили в глубинных условиях на среде с послеспиртовой бардой (50%) с добавлением растворов различных концентраций некоторых минеральных солей (0,01-0,20 %), для оптимизации солевого обеспечение быстрого роста и ферментообразование грибом.

Активность ферментов, образующихся в культуральной среде изучали в течение 120-144 часов в динамике роста гриба, отбирая пробы для анализа через каждые 6-часов.

 Активность целлюлазы ( эндоглюканазы – К.Ф. 3.2.1.4 (эндо-1,4 бета-глюкан-4-глюкангидролаза) и ксиланазы- К.Ф. 3.2.1.8 (1,4 бета-ксилан ксиланогидролаза) определяли по методу М.Л. Рабинович, Фениксовой и др. [21], амилазы –К.Ф.3.2.1.2. определяли по ГОСТ – 20264.2-88 [22]

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Благодаря тому, что минеральные элементы питания не только благоприятно влияют на рост и развитие микроорганизмов, в частности грибов, но и в интенсификации метаболических процессов, протекающих в микробной клетке, оказывая различное влияние также и на активности образующиеся ими ферментов. Поэтому, для определения влияния солей на образование ферментов грибом Agaricus bisporus sp 12 изучали действие различных минеральных солей магния, натрия, калия, фосфора, (в виде солей хлора, сульфата, дигидрофосфата) в различных концентрациях (0,01-0,2 %), путем включения указанных солей в состав питательной среды, содержащей 50 % после спиртовой барды, ранее подобранной нами концентрациях -50 %, выращенной в глубинных условиях в течение 120-144 часов культивирования [ 23,24]. Контролем служила среды с 50 % бардой, без включение минеральных солей.

Изучением влияния солей магния сульфата на рост и образование ферментов культурой Agaricus bisporus sp 12 было установлено, что высокую активность гриб проявил в отношении гидролиза целлюлозы, образуя высокую целлюлазную активность в количестве 7,2 и 7,1 ед/мл при включении 0,10-0,15 % магния сульфата, что способствовала увеличение активности фермента на 38 %. При увеличении концентрации магний сульфата до 0,2 % наблюдали иную картину, т.е активность целлюлазы резко снижалась до 4,5 ед/мл, т.е. активность фермента ингибировалась на 11.8 %. 

Рисунок 1. Ферментативная активность гриба Agaricus bisporius 12 на среде с бардой при внесении MgSO4 различных концентрациях

Увеличение целлюлазной активности наблюдается на 41, 2 % при концентрации соли 0,10 %, ксиланазы на 51% при внесении 0,01 % MgSO4, тогда как активность амилазы составила 27 % при концентрации соли 0,2 % (Рис.1).

Рисунок 2. Ферментативная активность гриба Agaricus bisporius 12 на среде с бардой при внесение KCl различных концентрациях

Увеличение активности целлюлазы 5,6 % наблюдалось при внесениеи 0,05 % концентрации KCl, ксиланазы на 66 % при дозе соли 0,1 %, амилазы на 9,0 % при использовании 0,2 % раствора данной соли Оказалось, что присутствие ионов KCl весьма благоприятно влияет на образование ксиланазы, увеличивая активность фермента почти на 60 %.

Рисунок 3. Ферментативная активность гриба Agaricus bisporius 12 на среде с бардой при внесение K₂HPO₄ различных концентрациях

Испытание соли K₂HPO₄ в концентрации 0,10 % приводило к увеличению активности целлюлазы на 39,7 %, ксиланазы на 71 %. Интересным был тот факт, что под влиянием соли K₂HPO₄ в любых испытанных концентрациях не повлияло на активность амилазы, т.е если а-амилазная активность в контролней среде составила 2,4 ед/мл, то активность также варьировала в количестве 2,3 и 2,4 ед/мл в присутствии 0,01-0,20 % соли K₂HPO₄ .

Рисунок 4. Ферментативная активность гриба Agaricus bisporius 12 на среде с бардой при внесение NaNO3 различных концентрациях

Использование нитратный соли натрия (NaNO3) в концентрации 0,15 % приводило к увеличению активности целлюлазы на 37,3%, ксиланазы -147 % в концентрации 0,20 %, , т.е. увеличивая почти в 1,47 раза, амилазы на 9,5 % и 14,8 % также в концентрациях NaNO3 0,15-0,20 % в питательной среде.

Таким образом, изучение влияния минеральных солей на образование некоторых гидролитических ферментов (целлюлазы, ксиланазы, амилазы) грибом Agaricus bisporus sp 12 в глубинных условиях культивирования в течение 120-144 часов роста показали разные результаты, Так например, включение солей магния, натрия, калия, фосфора, (в виде солей хлора, сульфата, дигидрофосфата) в различных концентрациях (0,01-0,2 %) в питательную среду с послеспиртовой барды по разному влияли на образование ферментов по сравнению с контрольной средой (50 % барда без включение минеральных солей).

Высокую целлюлазную активность (7,2 и 7,1 ед/мл) гриб проявил в отношении гидролиза целлюлозы, образуя высокую целлюлазную активность в количестве 7,2 и 7,1 ед/мл при включении в среду 0,10-0,15 % MgSO4, что способствовало увеличению активности фермента на 38 %. При концентрации соли 0,2 % активность целлюлазы резко снижалась до 4,5 ед/мл, т.е. активность фермента ингибировалась на 11.8 %.  Увеличение целлюлазной активности наблюдается на 41, 2 % при концентрации соли 0,10 %, ксиланазы на 51% при внесении 0,01 % MgSO4, тогда как амилазы на 27 % при концентрации соли 0,2 % (Рис.1)

Увеличение активности целлюлазы 5,6 % наблюдалось при внесениеи 0,05 % концентрации KCl, ксиланазы на 66 % при дозе соли 0,1 %, амилазы на 9,0 % при использовании 0,2 % раствора данной соли Оказалось, что присутствие ионов KCl весьма благоприятна влияет на образование ксиланазы, увеличивая активность фермента почти на 60 %.

Испытание соли K₂HPO₄ в концентрации 0,10 % приводило к увеличению активности целлюлазы на 39,7 %, ксиланазы на 71 %. Но, под влиянием соли K₂HPO₄ в испытанных концентрациях не повлияло на активность амилазы и оставалась одинаковой наряду с контролем (2,3 ед/мл и 2,4 ед/мл ). Использование соли NaNO3 в концентрации 0,15 % приводило к увеличению активности целлюлазы на 37,3%,. Высокая активность гриба проявилась в отношении ксиланазы достигая самого максимума среди всех испытанных солей на 147 %, причем в высокой концентрации - 0,20 %. Если, увеличение ксиланазы составила почти в 1,47 раза, то активность амилазы составила 9,5 % и 14,8 % в присутствии NaNO3 в концентрациях 0,15-0,20 % в среде. .

Таблица.

Распределение максимальной активности гриба Agaricus bisporius 12 в зависимости от присутствии минеральных солей питательной среды

Проведенные эксперименты показали, что присутствие минеральных солей существенное влияние оказывало прежде всего на активность ксиланазы, достигающее до 147 % в присутствии NaNO3, далее до 71,0 % в присутствии K₂HPO_4, затем до 66 % в присутствии соли KCl, и наконец до 51 % в присутствии солей MgSO4. Особое внимание заслуживает тот факт, что на среде с KCl целлюлази проявила самую низкую активность, увеличение которого составила всего 5,6 %. Эксперименты показали, что каждая соль имела разное влияние на активности ферментов, образуемых грибом Agaricus bisporius 12 Самыми благоприятными были соли NaNO3 и K₂HPO_{4 ,} затем MgSO и наконец ионы KCl

На сегодняшний день главной задачей грибоводства является создание высокоэффективной технологии получения качественного посевного материала. Одним из приемов является подбор питательных сред, содержащих необходимые компоненты для стимулирования роста мицелия и обеспечения его конкурентоспособности и, в конечном итоге, высокой урожайности. Опираясь на ранее известные литературные и полученные нами данные сделано заключение о том, что создание экспериментальной среды для выращивания шампиньонов можно решить с помощью введения различных минеральных солей, которые способствую увеличению активности ферментов почти в 2 раза. Как и другие базидиальные грибы [4,5,6,11,12, 16. 17], шампиньоны имеют ферментную систему, содержащую больше всего ксиланазу, гидролизующуй гемицеллюлозные остатки в лигноцеллюлозном субстрате. .

При изучении влияния минеральных солей на рост мицелия шанпиньонв было выявлено наилучшее действие MgSO4 в концентрации 0.1%

Список литературы:

1. Александрова Е.А., Завьялова JI.A., Терешина В.М., и др. Получение плодовых тел и глубинного мицелия Lentinus edodes (Berk.) sing. // Микология и фитопатология.-1994. -Т. - Вып. 3.- С. 34-39.
2. Ахмедова З.Р, Белецкая О. Далимова Г. Халикова М. Давранов К. Шарипова А.Отбор и культивирование лигнин и целлюлозоразрущающих грибов. Микробиология,1994, Т. 63, N5, С. 929-936
3. Ахмедова З.Р. Биоконверсия отходов хлопководства дереворазрушающими базидиальными грибами, 1995, т.64, N3, С. 381-386.
4. Ахмедова З.Р. Биодеградация растительных отходов грибом P.ostreatus1.Образование биологически ценных продуктов., Биотехнология, Москва, 1992, N5,С. 65-68
5. Ахмедова З.Р. Биодеградация растительных отходов грибом P.ostreatus 2. Образование ферментов, Биотехнология, Москва, N5, С. 69-71..
6. Ахмедова З.Р., Белецкая О. П. Целлюлазы и лигниназы базидиомицетов. Прикл. биохим. и микробиология,. 1993, N6, С. 823-828
7. Ахмедова З.Р Белецкая О. Далимова Г. Халикова М. Давранов К. Шарипова А. Целлюлолитические, ксиланолитические и лигнолити- ческие ферменты гриба P.ostreatus. Прикл. биохим. и микробиология, 1994, вып.1. Т.30, С. 42-48
8. Ахмедова З.Р. Выделение, очистка и изучение некоторых свойств внеклеточных лигнин-перок- сидаз дереворазрушающего гриба P.ostreatus. Международный журнал «Химия природных соединений» 1996, N3, С. 394-402
9. Ахмедова З.Р. Изучение субстратной специфичности внеклеточных лигнин-пероксидаздеревораз-рушающего гриба P.ostreatus. Международный журнал «Химия природных соединений» 1996, N4, С. 596-601.
10. Ахмедова З.Р. .Абылаева Б. Рахимов Д.А., Биоконверсия растительных отходов базидиальными грибами. Образование углеводов, 1997, Специальный выпуск, С. 13-15.
11. Ахмедова З.Р. .Абылаева Б.А., Рахимов Д.А., Давранов К. Д. Углеводный состав препаратов грибного происхождения, Международный журнал «Химия природных соединений 1997, N3 , С. 352-357.
12. Ахмедова З.Р. Кузьмина Л.А. Кинетические параметры пероксидазы Pleurotus ostreatus УзБИ-И105, . Международный журнал «Химия природных соединений», 2001, Специальный выпуск С. 112-116.
13. Белова Н.В. Базидиомицеты источники биологически активных веществ // Растительные ресурсы.-1991.-Вып.2.- С.8-17.
14. Билай В.И. Основы общей микологии. Киев.: Наукова думка.- 1989.-. 389 с.
15. Бисько Н.А., Дудка И.А. Биология и культивирование съедобных грибов рода вешенка. Киев.: Наукова думка.- 1987.- С.69-73.140
16. Вакин А.Т. Хранение круглого леса.- М.: Лесная промышленность, 1964.-С. 47-59.
17. Дудка И.А. Промышленное культивирование съедобных грибов Киев.: Наук, думка.- 1979.- 120 с.
18. Препараты ферментные, Метод определения амилолитической активности. ГОСТ 20264.1-88, Государственный Комитет СССР по стандартам, Москва, 1988.
19. Рабинович М.Л., Клесов А.А., Березин И.В. Кинетика действия целлюлолитических ферментов Geotrichumcandidum. Вискозиметрический анализ кинетики гидролиза карбоксиметил целлюлозы. Биоорг. химия, 1977, т.З, С. 405-414.
20. Шонахунов Т.Э., З.Р.Ахмедова Возможности микробной конверсии послеспиртовой барды для получения кормового продукта, Журнал «Микробиология и вирусология», Казахстан, 2019 г.. №2, С. 52-64
21. Perlman D. Chemical environments for fungal growth carbon sourses // The fungi. 1965.- Vol. l.-P. 479-488.
22. Davies J.S., Scoper R. H. Purification of some tricarboxylic acid enzymes from beef heart using affinity elution chromatography. Anal. Biochem.- 1981-Vol. 114.-N l.-P. 19-27.
23. Drew S.W. et al. Chemicals foodstocks and fuel from lignin // AICHE Symp. Ser. -1978. -Vol. 74.- N 181. -P.21-25.
24. Shonakhunov T.E., Akhmedova Z.R. Development of microbial conversion for producing mixed feeds and feed additives for various kinds of farm animals, Austria science scientific journal, 2019, №27, part.1. 24-28