Технология размножения картофеля сорта «суперэлита» методом in vitro

АННОТАЦИЯ

В статье объясняется в основном новый способ размножения растений in vitro на основе воздействия экзогенных факторов, при которых из растительных клеток и тканей может образовываться целый растительный организм. Метод in vitro размножения растений отличается от других методов тем, что имеет ряд преимуществ. В лабораторных условиях представлена информация о получении высококачественных, генетически идентичных, безвирусных посадочных материалов для выращивания картофеля в большом количестве клонированных микрокапсул и микроузлах.

ABSTRACT

The article mainly discusses a new method of plant propagation – in vitro, ie the formation of a whole plant organism from plant cells and tissues under the influence of exogenous factors. The in vitro method of plant propagation differs from other methods in that it has a number of advantages. There have been reports of large-scale clonal micro-propagation of potato plants in the laboratory and the production of high-quality, genetically identical, virus-free planting material for micro-tubers.

Ключевые слова: биотехнология, клетка, ткань, экзогенный, селекция, питательная среда, ауксин, цитокин, in vitro, корень, стебель, лист, микроузел, зрелое растение.

Keywords: biotechnology, Cell, tissue, exogenous, selection, nutrient medium, auxin, cytokinin, in vitro, root, stem, leaf, micro nodule, mature plant

В основном новый способ размножения сортов семенного картофеля заключается в том, что на основе воздействия экзогенных факторов in vitro образуется целый растительный организм из растительных клеток и тканей. Этот метод отличается от других методов тем, что имеет ряд преимуществ. Во-первых, он эффективен и экономичен, так как в процессе размножения из каждой каллозной клетки могут образовываться удобные побеги, которые образуют растение в благоприятных условиях культивирования. Во-вторых, в некоторых случаях это единственный способ размножения растений из культуры тканей. В-третьих, растения, полученные таким способом, вызывают интерес у селекционеров из-за генетических и морфофизиологических различий. Это дает селекционерам возможность выбрать характерные растения, имеющие важное хозяйственное значение и оценить их рост в полевых условиях.

Первый успех семян картофеля в микрокапитализации in vitro связан с культивированием верхушечной меристемы в специфической питательной среде, получением регенерирующих и микротрубочек. Но сфера применения микроклимата разнообразна и развивается с каждым днем. Это связано в первую очередь с сохранением редких и исчезающих видов растений картофеля с использованием техники in vitro и поставкой новых сортов в качестве семян на поля «суперэлиты».

Основным методом, применяемым при клонировании растений, является активация развития меристем, присутствующих в этом растении, за счет прекращения верхушечного доминирования.

Этого можно добиться двумя способами: а) меристема дуги стебля удаляется, а стержень микрокалькулируется в безгормональной среде; б) индуцируется развитие ветвей, выходящих из многих внутренних полостей путем добавления в питательную среду веществ, обладающих действием типа цитокина.

В качестве цитокинов в питательной среде используют 6-бензиламинопурин (BAP) или 6-фурфуриламинопурин (кинетин), а также 2-изопентиладенин (2ip) и зеатин. Полученные таким способом отростки отделяются от первичного экспланта и снова культивируются в свежеприготовленной питательной среде, стимулирующей пролиферацию внутренних меристем и увеличивающей образование всходов.

Используя метод активизации развития меристем, присутствующих в растении, картофель может получать от одной меристемы до 100 микротрубочек в год, а также с помощью этой технологии выращивать в пробирках ценные, безвирусные семенные материалы.

Еще один способ клонирования микрокапсулирования – случайная (адвентивная) индукция побегов в тканях эксплантов. Этот метод основан на регенерации зрелого растения путем культивирования отдельно выделенных частей растения в условиях благоприятной питательной среды и восстановления в нем недоразвитых органов.

В настоящее время в научно-практической лаборатории «Биотехнология» при ГУП «Центр развития цветоводства» при хокимияте Наманганской области ведутся работы по отделению тканей различных растений, выращенных в благоприятных условиях, а затем культивированию во вновь созданных питательных средах до образования листьев, корней и микротрубочек. Опыт показывает, что можно получить посадочный материал без вирусов, бактерий, грибов, генетически идентичный, в больших количествах, продолжая этот процесс как угодно.

В лаборатории выращивают несколько уникальных сортов картофеля, таких как «Ария», «Арнова», выращивают микроклональным методом in vitro. Сорта картофеля «Арнова», «Ария» отличаются большим содержанием крахмала, вкусовыми качествами, размером, энергичным стеблем, стойкостью к различным условиям. Благодаря тому что это растение любит водную среду, можно добиться более быстрого результата в микроклональном размножении.

Техника культивирования клеток и тканей in vitro, отличающаяся от картофельного растения, заключается в следующем: основным условием работы с культурами выделенных тканей является строгое соблюдение стерильности. Богатый состав питательной среды также является хорошим субстратом для роста микроорганизмов. Микроорганизмы легко повреждают растительные компоненты (экспланты), которые культивируются в питательной среде, поэтому и эксплант, и питательная среда должны быть стерилизованы. Все работы, проводимые с выделенной тканью (пересадка в культуру, перемещение в новую питательную среду), проводятся в стерильных помещениях (ламинарных боксах) при помощи стерильных инструментов, стерильность следует поддерживать даже в период выращивания отделенной ткани, так как при понижении температуры или при возникновении влаги через влажный забор сосуда в пробирку могут проникать микроорганизмы.

Ламинарно-боксовая стерилизация: рабочая внутренняя поверхность ламинара протирается 5 %-ным Накло. Затем в ламинар помещают спирт, гугур, 96 %-ный стакан спирта, стерилизованные банки, инструменты и стерилизованную водяную трубку. При разделении меристем в ламинар также кладут бинокулярную луковицу. За 2 часа до работы ламинарный бокс облучают ультрафиолетовой лампой бактериоцида. За два часа до работы внутреннюю поверхность ламинара протирают 70 %-ным спиртом. Перед началом работы руки тщательно промывают мылом, протирают спиртом и надевают стерильный халат, держат стерильную маску во рту.

Стерилизация посуды: посуда стерилизуется в сушильных шкафах в сухом тепле или во влажном паровом автоклаве. Перед стерилизацией посуду необходимо тщательно вымыть и просушить. Для мытья посуды используются различные моющие средства и Хромпик (раствор бихромата калия в серной кислоте). Вымытую посуду промыть в дистиллированной воде и высушить в сушильном шкафу. Чтобы предотвратить попадание инфекции из воздуха перед стерилизацией, зонды, горловину трубки закрывают алюминиевой фольгой. Затем посуду помещают в сушильные шкафы и нагревают в течение 2 часов при 500 °C, еще лучше стерилизуют под давлением в автоклаве, так как при нагревании во влажной среде микроорганизмы и их споры погибают еще лучше. В автоклаве стерилизуют различные стаканы, чашки Петри, пипетки, дистиллированную воду. Посуду заворачивают в фольгу и автоклавируют в течение 25–30 минут при 120 °C и 2 атмосферах.

Стерилизация оборудования: инструменты, скальпель, пинцет, ножницы, иглы стерилизуются в сушильном шкафу в течение 12 часов при 400 °C в сухом огне или при кипении в воде. Инструменты из железа не стерилизуются в автоклаве, так как под воздействием влажного пара они ржавеют. Перед началом работы и во время работы инструменты помещают в фарфоровые стаканчики, стерилизуют в 96 %-ном этиловом спирте и нагревают на огне. В спиртовом пламени нагреваются ланцеты, ножницы, пинцеты и микробиологические петли и держатся между стерильной бумагой. Стерилизованные инструменты используют только один раз, при повторном использовании их снова стерилизуют в спирте и нагревают на огне. Игольчатые ножницы и шпаклевки стерилизуют в спирте.

Стерилизация материалов: хлопок, марля, хлопчатобумажная пробка, фильтровальная бумага, канаты и салфетки, используемые в эксперименте, стерилизуются в автоклаве при температуре 120 °C и давлении 25–30 минут.

В основном микроклональное размножение растений наблюдается при выращивании в питательных средах, приготовленных с добавлением в различных пропорциях веществ, содержащих экстракты из стебля, листьев и семян. Каждое растение имеет свою оптимальную питательную среду.

Чтобы вырастить картофельное растение в лабораторных условиях, то есть методом in vitro, сначала сажают в грунт сорт качественного картофеля, который проходит период покоя, в течение 7 часов после того, как вырастает надземная часть, срезают с зеленого стебля на 2–5 см и промывают в дистиллированной воде, затем стерилизуют в 1 %-ном растворе гипохлорида натрия в течение 20 минут. Стерилизованную часть растения промывают в дистиллированной воде и сушат в ламинарном боксе.

По методу in vitro в основном экспланты и семена стерилизуют в стерильном растворе 5–20 мин, а затем несколько раз промывают в стерильной воде. Время стерилизации будет зависеть от характера экспланта и активности стерильного раствора. Семена стерилизуют 10–20 мин, вегетативные – 5–10 мин. Полученные для культивирования растительные экстракты сначала протирают в мыльной воде и ополаскивают в дистиллированной воде, а затем в течение нескольких секунд 70 %-ным этанолом, а семена 1–2 мин вливаются в спирт. Спирт повышает эффективность стерилизации основного стерилизующего раствора вместе со стерилизацией тканей. После этого ткани промывают также в стерильной воде.

Вышеперечисленные методы избавляют растения только от внешних инфекций. Если внутри экспланта имеется инфекция, то необходимо обработать его антибиотиками. В основном тропические и субтропические растительные ткани богаты внутренними инфекциями. Зараженную грибами или бактериями культуру можно обнаружить уже через 1–14 дней после посадки. Необходимо предотвращать распространение в помещение культур, пораженных микроорганизмами, не загрязняя воздух.

При клональном размножении картофельных растений мы использовали питательную среду (табл. 1).

Таблица 1.

В питательной среде цитокин или его смесь с ауксином в соотношении 10:1 или 100:1, в качестве ауксина чаще всего выращивают в виде индол-3 жирных кислот (ИМК) или α-нафтоловой уксусной кислоты (НСК), 0,1–0,5 мг/л 6-адсорбента на носу и в кормовой среде Скуги. Через 3–4 недели после культивирования развиваются растения меристемы, из которых формируются тасофидиальные побеги. Они быстро разрастаются и образуют новые побеги. На опавших ветках появляются листья, на нижней части образуются новые адвентивные побеги. Эти побеги отделяются и переносятся в новую питательную среду. В питательной среде, содержащей цитокины, продолжается образование боковых ветвей и начинается процесс оплодотворения узла, в то время как в питательной среде без гормона происходит нормальное растение с листьями, корнями в течение 4–6 недель [3]. На рисунке 1 показано состояние картофельного («Ариэля», «Арнова») растения в лабораторных условиях, подвергнутого микрокапсулированию клоном методом in vitro, а затем в виде зрелого растения.

Рисунок 1

Вывод. Таким образом стало ясно, что в лабораторных условиях при новом способе вегетативного размножения растений методом in vitro – с помощью метода клонированного микрокапсулирования остается возможность получения большого количества высококачественных, генетически идентичных, безвирусных посадочных материалов в лабораторных условиях, если от одной первичной растительной клетки (стебля, листьев и т.д.) останется целый растительный организм.

Список литературы:

1. Артикова Р., Муродова С. Сельскохозяйственная биотехнология : учеб. пособие. – Ташкент : Наука и технология, 2011. – 288 с.
2. Давронов К., Худжамшукуров Н. Общая и техническая микробиология : учеб. пособие. – «Ташгау», 2004. – 280 с.
3. Лабораторные занятия по микробиологии : учеб. пособие / М.А. Зупаров [и др.]. – «Ташгау», 2014. –113 с.
4. Мустакимов Г. Основы физиологии растений и микробиологии : учеб. пособие / преподавательский состав. 1995. – 359 с.
5. Сельскохозяйственная биотехнология : учеб. пособие для проведения лабораторных занятий / М.А. Зупаров [и др.]. – «Ташгау», 2016. – 104 с.
6. Холмуратов Э.Г., Насырова Г.Б. Структурозависимое действие цитокининов в практическом применении биотехнологической коллекции картофеля // Вестник НУУз. – Ташкент, 2009. – № 3. – С. 175–177.
7. Regulation of plant growth by cytokinin / T. Werner, V. Motyka, M. Strnad, T. Schmülling // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98. – 2001. – P. 10487–10492
8. Skoog F., Miller C. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissue cultured in vitro // Symp Soc Exp Biol. – 1957. – № 11. – P. 118–131.