Биотехнология получения биомассы микромицетов и приготовления высокобелковых комбикормов из растительных остатков

АННОТАЦИЯ

В статье приведены результаты исследований по получению биологически активных веществ, продуцируемых грибами рода Trichoderma.

Данная микробная биомасса отличается тем, что в качестве комплекса биологически активных веществ содержит биомассы с максимальным содержании белка и целлюлазы, полученной при твердофазном культивировании в течение 36 ч. Кормовую добавку вводят в рацион птиц.

ABSTRACT

The article presents the results of studies on the production of biologically active substances produced by the fungi of the genus Trichoderma. This microbial biomass is characterized in that, as complex of biologically active substances, contains biomass maximum protein and cellulases obtained by solid-phase cultivation for 36 hours. The feed additive is introduced into the diet of birds.

Ключевые слова: биологический, активный, продуцент, биомасса, белок, целлюлаза, целлюлоза, твердофазный, культура, корма, рацион.

Keywords: biological, active, producer, biomass, protein, cellulase, cellulose, solid phase, culture, feed, diet.

Введение. Одной из важнейших проблем сельского хозяйства является использование растительных остатков и отходов зернопроизводства для кормления животных. Однако при использовании отходов сельского хозяйства в качестве корма возникает ряд трудностей, главной из которых является их низкое качество. Поэтому в настоящее время широко проводятся исследования по изучению роли различных видов микроорганизмов, способных интенсивно развиваться и накапливать биомассу на содержащих лигноцеллюлозу отходах сельского хозяйства, обогащая их белком [12; 11; 4; 13; 2; 5; 18].

Материалы и методы исследований. При изучение целлюлолитической активности у полученных протопластных культур исследуемый штамм выращивали глубинным и поверхностным способами культивирования. При изучении условий глубинного культивирования грибов на биосинтез целлюлолитических ферментов и белка исследуемые культуры выращивали в колбах Эрленмейера емкостью 250 мл, со 100 мл среды, помещенных на качалку со скоростью вращения 100–200 об/мин. Грибы выращивали на двух питательных средах – среде Mandels [19] и среде Farid [17]. Для выяснения влияния источников углерода в среде на образование целлюлолитических ферментов и белка исследуемыми культурами последние выращивались на вышеуказанных средах с добавлением в качестве источника углерода камыша, пшеничной соломы, рисовой лузги в количестве 2 %. Для выяснения оптимальной температуры роста и образования целлюлазы и белка протопластные культуры выращивали при оптимальном значении рН для каждой культуры и температуре 25, 30 и 35 °С. Посевным материалом служили суспензии конидий 7 суточных культур грибов плотностью 1×10⁶ мл. Количество инокулята составляло 2 % от объема среды при глубинном и 20 мл на 100 г субстрата при твердофазном способах культивирования.

Результаты исследований и обсуждение. Изучение содержания белка при выращивании на различных растительных остатках показало, что наибольшее количество белка образует Trichoderma harzianum-25/П при поверхностном выращивании на пшеничных отрубях (18 %). Таким образом, использование для гриба Trichoderma harzianum методов регенерации протопластов позволило получить новую протопластную культуру Trichoderma harzianum-25/П, являющуюся высокоактивным продуцентом целлюлолитических ферментов и белка. Мы изучали влияние температуры культивирования в течение 120 час на способность образовать белок грибом Trichoderma harzianum-25/П на пшеничных отрубях при оптимальном значении рН 5,5–6,0. При оптимальном значении рН 5,5–6,0 среды наиболее высокая способность образовывать биомассу и белок у исследуемых культур наблюдается при 28 °С. Полученные данные показали, что наиболее высокое повышение содержания белка отмечалось на субстрате с добавлением 0,5 % (NH₄)₂SO₄ и 0,1 % NaNO₃. Таким образом, подобранная среда с добавлением 0,5 % (NH₄)₂SO₄ и 0,1 % NaNO₃ обеспечивает значительное повышение образования белка. Содержание белка на этих субстратах у протопластного штамма значительно выше, чем у исходных штаммов. Необходимо отметить, что при добавлении 0,5 % (NH₄)₂SO₄ к субстрату содержание белка биомассы доходило у Trichoderma harzianum-25/П до 40,6 % (табл. 2). На основании полученных данных нами был разработан регламент культивирования штамма Trichoderma harzianum-25/П и получения белка биомассы с целью его рекомендации к внедрению в производство. Для получения высокобелковой биомассы рисовые отходы использовались в измельченном виде: рисовая мучка, зерновые отходы риса измельчались в шаровой мельнице до размера частиц 0,20; 0,5; 0,72; 1,0 мм, затем увлажнялись до 40, 60 и 75 % влажности питательной средой следующего состава, г/л: (NH₄)₂SO₄ – 3,0; К₂HPO₄ – 0,5; MgSO₄ – 0,05; CaCl₂ – 0,3; пептон – 2,0; рН – 5,5; водопроводная вода. Изучали биохимический состав полученного белка биомассы. На субстрате варианта отруби + рисовая мучка (1:1) образуется микробная биомасса с содержанием белка 40,6 % от а.с.в. При этом содержание клетчатки снижается с 12,0 % до 4,5 %. Содержание лизина возрастает до 2,64 %, в то время как его содержание в исходном субстрате составляло 1,5 %. Содержание метионина повышается с 0,96 % в исходном субстрате до 1,02 % в полученный микробной биомассе. Целлюлазная активность составляет ед/г: экзо-1,4-β-глюканаза – 42,4; эндо-1,4-β-глюканаза – 78,4; гемицеллюлаза – 84,5; ксиланаза – 85,6; целлобиаза – 86,2. В вариантах отруби + рисовая лузга (1:1) и отруби + рисовая мучка + зерновые отходы риса (1:1:1) разница в содержании протеина по сравнению с исходным субстратом оказалась меньшей. На основании результатов проведенных исследований предложена полупроизводственная технологическая линия по получению нового комбикорма для птицеводства на основе местного вторичного сырья с заменой дефицитных компонентов на микробную биомассу. Технология получения кормовой добавки заключается в выращивании штамма гриба Trichoderma harzianum-25/П в питательной среде с пшеничным отрубями при твердофазной или глубинной ферментации. Биомассу стандартизуют, фасуют и упаковывают. Биомасса и культуральная жидкость могут быть предварительно высушены любым известным способом. Кормовой белковый продукт может быть включен в состав рецептуры комбикормов для птиц. Кормовая добавка в качестве комплекса биологически активных веществ содержит биомассу и/или культуральную жидкость, полученную при культивировании штамма гриба Trichoderma harzianum-25/П на среде с пшеничный отрубями + рисовой мучкой. Способ выращивания птицы включает введение в нормальный рацион молодняка птицы данной кормовой добавки. Данный метод позволяет повысить продуктивность, естественную резистентность сельскохозяйственных птиц, компенсировать в рационе кормления дефицит аминокислот, витаминов, микроэлементов, повысить усвояемость кормов, нормализовать микрофлору желудочно-кишечного тракта (табл. 1). Задачей данного метода является создание эффективной и экономичной биологически активной добавки к корму на основе нового штамма гриба Trichoderma harzianum-25/П, более продуктивного по белку и целлюлазе с использованием простой и безотходной технологии производства, позволяющей использовать не только биомассу гриба, но и культуральную жидкость [16; 15; 7; 14; 1; 9; 8; 3; 6; 10]. Добавление к основному рациону птицы предлагаемой кормовой добавки позволяет обогатить корм биологически активными веществами и придает ему лечебно-профилактические свойства, что позволяет повысить продуктивность птицы, увеличить усвоение питательных веществ корма за счет усиления пищеварительных процессов в организме птицы. Предлагаемая кормовая добавка в качестве комплекса биологически активных веществ содержит биомассу и/или культуральную жидкость, полученную при культивировании штамма гриба Trichoderma harzianum-25/П на среде, содержащей пшеничные отруби + рисовую мучку. При поверхностном росте на среде Чапека мицелий темно-зеленый, обратная сторона не окрашена, на 3-й день роста колонии 10–12 см в диаметре, с концентрическими кругами, фиалоспоры округлые или обратно-яйцевидные 2,8–3,2×2,5–2,8 мкм.

Выводы. Таким образом, полученные результаты показали, что протопластная культура T.harzianum-25/П является перспективным продуцентом грибного белка и может быть использована для обогащения белком растительных отходов как в условиях глубинного, так и твердофазного культивирования. Анализ полученных данных позволяет сделать вывод, что применение белка биомассы Trichoderma harzianum-25/П повышает прирост живой массы на 12–14 %. Кормовая добавка для птицеводства, содержащая комплекс биологически активных веществ, продуцируемых Trichoderma harzianum-25/П, отличается тем, что в качестве комплекса биологически активных веществ содержит биомассы максимальные в содержании белка и целлюлазы, полученной при твердофазном культивировании в течение 36 ч. Кормовую добавку вводят в рацион птиц.

Таблица 1.