ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ НАНОАСКОРБАТА ХИТОЗАНА Bombyx mori И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ В ШЕЛКОВОДСТВЕ

АННОТАЦИЯ

В настоящей работе описан синтез комплекса наноаскорбат хитозана Bombyx mori на основе хитозана и аскорбиновой кислоты методом ионотропного гелеобразования. Разработана технология производства полимер-препаративной формы наноаскорбата хитозана и изучены его физико-химические свойства с помощью спектроскопических методов. При соотношении компонентов хитозана и аскорбиновой кислоты 4:1 обнаружен высокий выход конечного продукта и установлено, что данное условие синтеза является оптимальным в образовании наноаскорбат хитозана.

ABSTRACT

In the present study, the synthesis of a Bombyx mori chitosan nanoascorbate complex based on chitosan and ascorbic acid by the ionotropic gelation method is described. A technology for the production of a polymer–preparative form of chitosan nanoascorbate was developed, and its physicochemical properties were investigated using spectroscopic methods. At a chitosan to ascorbic acid component ratio of 4:1, a high yield of the final product was obtained, and this synthesis condition was established as optimal for the formation of chitosan nanoascorbate.

Ключевые слова: наноаскорбат хитозана Bombyx mori, полимер- препаративная форма, степень связывания, размер наночастиц, ИК- спектроскопия.

Keywords: Bombyx mori chitosan nanoascorbate, polymer–preparative form, degree of binding, nanoparticle size, FTIR spectroscopy.

Введение

Поликатионные и полианионные полисахариды – основной компонент морских водорослей, ракообразных, мух и коконов тутового шелкопряда − могут рассматриваться как потенциальные источники иммуномодуляторов. Хитозан (ХЗ) является нетоксичным, биосовместимым, биоразлагаемым полисахаридом, обладающим антимикробным, антиоксидантным, противовоспалительным, иммуностимулирующим действием и другими фармакологическими свойствами: улучшает заживление ран, участвует в восстановлении тканей, может служить в качестве транспортного средства для доставки лекарственных средств, таких как аскорбиновая кислота [1-3].

Известно, что хитозан не растворяется в воде, но хорошо растворяется в разбавленных органических кислотах, и получение водорастворимых кислотных производных ХЗ расширяет спектр его применения в сельском хозяйстве [3]. У производных хитозана с аскорбиновой кислотой возрастают ранозаживляющие, противомикробные, ростостимулирующие свойства по сравнению с исходными компонентами [4, 5]. Сравнительный анализ биологической активности нанопроизводных хитозана c органическими кислотами определил повышенный интерес к нанопроизводным хитозана с аскорбиновой кислотой, поскольку полученный в результате реакции продукт является нетоксичным для окружающей среды и обладает противомикробными свойствами к заболеваниям растений и животных [5, 6].

Несмотря на широкомасштабные исследования биологически активных свойств нанопроизводных хитозана, в литературе не обнаружены данные о применении нанопроизводных хитозана с аскорбиновой кислотой в области шелководства [3-5]. Исходя из вышеизложенного, впервые была получена препаративная форма наноаскорбата хитозана с целью применения в шелководстве.

Цель работы – разработка технологии получения полимер- препаративной формы нанопроизводной хитозана с аскорбиновой кислотой и ее применение в шелководстве в качества стимулятора роста и развития тутового шелкопряда.

Экспериментальная часть

Наноаскорбат хитозана получен методом ионотропного гелеобразования в присутствии сшивающего агента − триполифосфат натрия (ТПФNa) в водном растворе при варьировании соотношений исходных компонентов и рН раствора. Количество аскорбиновой кислоты в составе аскорбата хитозана определено методом щелочного титрования в присутствии индикатора фенолфталеина. Степень связывания аскорбиновой кислоты определена на основе соотношения (M_АК) эксп. / (M_АК) расч., указанного в работе [7].

ИК-спектры получены на ИК-Фурье-спектрометре «Inventio-S» («Bruker», Германия) в диапазоне от 500 до 4000 см^–1.

Размер наночастиц наноаскорбат хитозана изучали методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) на приборе «Agilent 5500» («Agilent», США). В работе применяли кремниевые кантилеверы жесткостью 9.5 Н×м^–2 с частотой 145 кГц.

Также определено влияние полимер-препаративной формы наноаскорбата хитозана на рост и развитие тутового шелкопряда в лабораторных и полевых условиях. Полевые исследования проводили в г. Термез Сурхандарьинской области в полевых условиях специализированного предприятия «Inter Silk Pro». Также проводили ряд исследований в лаборатории «Шелковица тутового дерева и болезни деревьев и их вредители» Научно-исследовательского Института шелководства. Сорта тутового шелкопряда «Узбекистан-6» и корм для них - листья тутовника обрабатывали 0.025 % раствором экологически безопасной полимер-препаративной формы наноаскорбата хитозана и аскорбат хитозана.

Обсуждение результатов

С целью получения препаративной формы наноаскорбат хитозана Bombyx mori проводили синтез при соотношении компонентов хитозана (ХЗ) и аскорбиновой кислоты (АК) 4:1 в присутствии стабилизатора − триполифосфата натрия (ТПФNa), при этом отбирались пробы для определения количества избыточной аскорбиновой кислоты. Для синтеза наноаскорбата хитозана использовали образец хитозана с молекулярной массой 164 кДа и степенью деацетилирования (СДА) 84 %. Синтез наноаскорбата хитозана осуществляли в пилотной установке (в реакторе с реакционным объемом 15 л), контролируя температуру реакции в диапазоне 50⁰ С. Время реакции 60 минут. Установлено, что выход реакции образования наноаскорбата хитозана в среднем составляет 80,6 %. Полученные результаты подтверждают, что при соотношении компонентов 4:1 обнаружены самые высокие степень связывания аскорбиновой кислоты и выход конечных продуктов наноаскорбата хитозана, поэтому это соотношении компонентов выбрано в качестве оптимального условия. Апаратная схема процесса представлена на рисунке 1.

Рисунок 1. Аппаратная схема производства

1- 2 % Уксусная кислота; 2 - ХЗ Bombyx mori; 3 - Подготовка раствора в реакторе; 4 – 0.1 М NaOH; 5 - Фильтр; 6 - Лиофильная сушка; 7 - Получение НАХЗ в реакторе; 8 - Аскорбиновая кислота (АК); 9 - 0.5 % раствор ТПФNa; 10 - Фильтр; 11- Центрифуга; 12 - Реактор для подготовки ППФ НАХЗ; 13- 0.25 % МГЭЦ; 14 - Фильтр; 15 - Готовый продукт

Стадия подготовки раствора хитозана Bombyx mori (ТП-1) включает в себя подготовку 2%-ного раствора хитозана в растворителе − 2%-ной уксусной кислоте, затем проводится механическая очистка с помощью фильтра с размером пор 1 мкм. После механической очистки раствор хитозана направляется для получения очищенного (депротонированного) хитозана. Стадия ВР1 включает подготовку раствора NaOH = 0.5 М. Расчетное количество едкого натра через дозатор смешивается с расчетным количеством воды. Полученный щелочной раствор направляется на стадию технологического процесса ТП2. В процессе ВР-2 проводится нейтрализация депротонированного хитозана посредством воды до нейтральной рН среды. Далее определяется концентрация хитозана в составе осадка очищенного хитозана, и полученная масса хитозана отправляется на стадию технологического процесса ТП3. Стадия реакции образования наноаскорбат хитозана (ТП-3) включает в себя процесс образования нанокомплекса хитозана с аскорбиновой кислотой в присутствии стабилизатора − триполифосфата натрия за счет донорно-акцепторной связи. В процессе образования наноаскорбат хитозана контролируется соотношение компонентов хитозана и аскорбиновой кислоты до 4:1. Для этого включается парогенератор, пар поступает в рубашку реактора и нагревает содержимое реактора до температуры 50 ⁰С. Система перемешивается 60 минут до установления рН 5,6 - 6,5 реакционной системы. Процесс стабилизации и осаждения наноаскорбат хитозана (ТП-4, ТП-5) проводится с добавлением 0.5 %-ного раствора Na₅Р₃O₁₀ до установления соотношения компонентов ХЗ:АК:ТПФ 4:1:0.25. Наноаскорбат хитозана посредством центрифуги (марки GFTL-500, объем-50 литр, скорость вращения- 1200-1500 обр. мин.) отделяется в виде конечного продукта (ТП-6). Готовый продукт «Наноаскорбат хитозана» выгружается и переносится в реактор, где готовится полимер-препаративная форма с помощью водного раствора метилгидроксиэтилцеллюлозы при температуре -45-50⁰С (ТП-7). После образования однородного раствора ППФ наноаскорбат хитозана продукт разливается в 20-ти литровые канистры, далее готовая продукция поступает на склад готовой продукции для реализации.

Структурные свойства образцов исходных компонентов − аскорбиновой кислоты и хитозана изучены методом ИК-спектроскопического исследования. Полученные результаты показали, что ИК-спектры хитозана имеют характерное поглощение аминных и метиленовых групп в областях 1600 см^-1 и 1420 см^-1, а также наличие свойственного поглощения гидроксильных групп в области 3000-3400 см^-1, что находится в полном согласии с литературными данными.  На ИК-спектрах аскорбиновой кислоты определены поглощения, относящиеся к гидроксильным группам в области 3200-2900 см^-1 и метиленовым группам в области 2915-2900 см^-1. В частности, в области 1750 см^-1 наблюдались поглощения, указывающие на карбонильные группы, расположенные в лактонном кольце, а в области 1600 см^-1 - на двойные связи енольных групп [7]. В ИК-спектрах полученных образцов наноаскорбата хитозана смещение оптических поглощений, характеризующих аминные группы, характерные для исходного хитозана, с 1600 до 1540 см^-1 свидетельствует об образовании донорно-акцепторной связи с участием аминогрупп и енольной группы аскорбиновой кислоты.

Также наблюдаемые новые низкоинтенсивные поглощения в районе 1796 см^-1 были идентифицированы как поглощения, характерные для лактонных групп аскорбиновой кислоты.

Рисунок 2. ИК- спектры хитозана Bombyx mori (1), наноаскорбата хитозана Bombyx mori (2)

Полученные результаты АСМ подтверждают, что в составе наноаскорбата хитозана присутствуют частицы размером от 200 до 800 нм. Результаты представлены на рисунке 3.

а)                                                               б)

Рисунок 3. Результаты АСМ исследования образца наноаскорбата хитозана (XЗ :AK: ТПФNa = 4:1:0.25),

 полученного на пилотной установке (рис. а-указан размер частицы до 709 нм, рис. б- указан размер частицы до 200 нм)

Обработку листьев тутовника - корма для тутового шелкопряда проводили три раза и скармливали тутовому шелкопряду сорта «Моноволтин». В результате наблюдалось увеличение выхода коконов в среднем на 10 % по сравнению с контролем (контроль-листья тутовника промывали водой). В результате это позволило увеличить жизнеспособность и продуктивность тутового шелкопряда. Для сравнения влияния препаратов в процессе кормления тутовых шелкопрядов было получено среднее количество коконов в каждом обработанном варианте, определен их средний вес, сравнены с контрольными вариантами. Эксперименты проводили в трех повторностях в варианте тутового шелкопряда сорта «Узбекистан-6». Полученные результаты представлены в таблице.

            Таблица 1.

Результаты урожайности сортов тутового шелкопряда «Узбекистан-6», обработанные препаратами АХЗ и НАХЗ (начальное количество червей 200 шт.)

Как видно из таблицы, среднее количество сформированных коконов при обработке аскорбат хитозаном (АХЗ) и наноаскорбат хитозаном (НАХЗ) выше на 3.5 %. Средняя масса коконов при обработке НАХЗ превосходила контрольный вариант на 5.15 %. При исследовании массы сформированных коконов было установлено, что обработка кормов тутового шелкопряда аскорбат хитозаном и наноаскорбат хитозаном приводит к увеличению средней массы коконов до 6.5 % по сравнению с контролем. 

Выводы

Таким образом, в результате исследований получены образцы наноаскорбата хитозана при оптимальном соотношении исходных компонентов ХЗ : АК : ТПФNa = 4:1:0.25, а их физико-химические и структурные свойства изучены методами ИК-спектроскопии и атомно-силовой микроскопии. Подтверждено, что размер частиц образцов наноаскорбата хитозана, полученных на пилотной установке, составляет от 200 до 800 нм. На основе результатов рассчитана урожайность коконов, сформированных из 20 г тутовых шелкопрядов. Результаты подтверждают, что при обработке тутового шелкопряда препаратами НАХЗ и АХЗ происходит значительное увеличение средней массы и выход коконов. Необходимо отметить, что при использовании раствора НАХЗ снижается количество несформированных коконов, что свидетельствует об увеличении жизнеспособности тутового шелкопряда.

Финансирование

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Республики Узбекистан «Разработка технологии производства полимерных форм лекарственных средств на основе нанотехнологий для профилактики и лечения заболеваний шелковичных червей» (AL-5121081319) 2024-2025 годы.

Вклад авторов

Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Список литературы:

1. Рашидова С.Ш., Милушева Р.Ю. Хитин и хитозан Bombyx mori: синтез, свойства и применение. Фан. Ташкент. 2009. С. 15—17.
2. Пирниязов К.К. Синтез, свойства и применение аскорбат хитозана Bombyx mori: Дис. … PhD. хим. наук. Ташкент. 2020. 106 c.
3. Пирниязов К.К., Рашидова С.Ш. Синтез аскорбата и наноаскорбата хитозана и их биологически активные свойства // Наука и инновационное развитие. 2020. № 5. С. 47-62.
4. Pirniyazov K.K., Tixonov V.E., Rashidova S.Sh. Oligochitosan and Oligochitosan Ascorbat: Preparation and Properties // International Journal of Modern Agriculture. 2021. V. 10. N 2. P. 1244-1262.
5. Pirniyazov K.K., Asrakulova D.I., Rashidova S.Sh. Synthesis and antimicrobial properties of chitosan nanoascorbate of Bombyx mori // Moscow University Chemistry Bulletin. 2024. V. 79. N 5. P. 345–350. https://doi.org/ 10.3103/S002713142470038X.
6. Искандаров Т.И., Романова Л.Х. и д. Первый токсикологический паспорт на препарат наноаскорхит. Министерство здравоохранения Республики Узбекистан. Ташкент, 2021. С. 2-6.
7. Pirniyazov K.K., Rashidova S.Sh. Study of the kinetics of Bombyx mori chitosan ascorbate formation // Bulletin of the Karaganda University. CHEMISTRY series. 2020. N 3(99). P. 38-43. https://doi.org/10.31489/2020Ch3/38-43