ВЛИЯНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ НА ФЕРМЕНТАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ ПОЧВ, ЗАГРЯЗНЕННЫХ ТЯЖЕЛЫМИ МЕТАЛЛАМИ

АННОТАЦИЯ

В данной работе было изучено влияние местных штаммов бактерий В. paralicheniformis 10, E. cloacae 5,  E. ludwigii 11, B. atrophаeus 4 и  B. subtilis 15 на ферментативную активность почв экспериментально загрязненных ионами тяжелых металлов (ТМ): Cd(II), Pb(II) и Cr(VI). В результате проведенных исследований в экспериментальной модельной системе «Почва+Тяжелые металлы+Микроорганизмы» наиболее распространенная ферментативная активность почв (каталазная, полифенолоксидазная, пероксидазная, инвертазная) показывает различные реакции на загрязнение ТМ, включая уменьшение, увеличение или отсутствие изменений. Так, при концентрации ионов кадмия 4,1 и 8,2 мг/кг почвы активность каталазы ингибируется на 7,5% и 19%, соответственно по сравнению с контролем.  Следует отметить, что активность каталазы была выше при концентрации ионов свинца 48,0 мг/кг почвы при внесении в почвенные образцы Enterobacter cloacae 5 на 7,2% и при концентрации ионов кадмия 4,1 мг/кг почвы в варианте с культурой Bacillus atrophаeus 4 на 3,4% по сравнению с контролем. Выявлено, что при концентрации ионов хрома 112,04 мг/кг почвы и 224,08 мг/кг почвы активность полифенолоксидазы ингибируется на 31,4% и 48,8% к контролю. Активность ПФО остается на уровне контроля (8,6 бензох/20 г почвы·4 час) в варианте “Почва+Тяжелые металлы+ Enterobacter cloacae 5” при концентрации свинца 48,0 мг/кг почвы (8,7 бензох/20 г почвы·4 час).

ABSTRACT

In this work, the effect of local bacterial strains B. paralicheniformis 10, E. cloacae 5, E. ludwigii 11, B. atrophаeus 4 and B. subtilis 15 on the enzymatic activity of soils experimentally contaminated with heavy metal (HM) ions: Cd(II), Pb(II) and Cr(VI) was studied. As a result of the studies in the experimental model system "Soil + Heavy Metals + Microorganisms", the most common enzymatic activity of soils (catalase, polyphenol oxidase, peroxidase, invertase) shows various reactions to HM pollution, including a decrease, increase or no change. Consequently, at a cadmium ion concentration of 4.1 and 8.2 mg/kg soil, catalase activity is inhibited by 7.5% and 19%, respectively, compared to the control. It should be noted that the catalase activity was higher at a lead ion concentration of 48.0 mg/kg soil when Enterobacter cloacae 5 was added to the soil samples by 7.2% and at a cadmium ion concentration of 4.1 mg/kg soil in the variant with the B. atrophаeus 4 cultures by 3.4% compared to the control. It was revealed that at a chromium ion concentration of 112.04 mg/kg soil and 224.08 mg/kg soil, the polyphenol oxidase activity was inhibited by 31.4% and 48.8% compared to the control. The polyphenol oxidase activity remained at the control level (8.6 benzohinon/20 g soil·4 h) in the “Soil + Heavy Metals + Enterobacter cloacae 5” variant at a lead concentration of 48.0 mg/kg soil (8.7 benzohinon/20 g soil·4 h).

Ключевые слова: микроорганизмы, тяжелые металлы, ферменты, активность, каталаза, полифенолоксидаза, пероксидаза, инвертаза.

Keywords: microorganisms, heavy metals, enzymes, activity, catalase, polyphenol oxidase, peroxidase, invertase.

Введение

Сегодня во всем мире потребность и деятельность человека растет день ото дня из-за увеличения численности населения, из-за чего наша окружающая среда загрязнена огромным количеством опасных загрязнителей из различных источников. Значительный процент поверхности земли составляет почва, которая является неотъемлемой частью и компонентом экосистемы, и формирует материальную основу для существования человека и растений. Согласно промышленной революции, крупномасштабное использование загрязняющих веществ приводит к возникновению опасных проблем со здоровьем. В следствии случайного и преднамеренного выброса ксенобиотиков, химикатов и токсичных газов в окружающую среду.  Поскольку тяжелые металлы (ТМ) не подвергаются химическому или микробному разложению, общая концентрация загрязняющих веществ сохраняется в течение более длительного времени после сброса в почвенную среду [9,10,17,18].

Микроорганизмы и ферменты являются важными компонентами почвы, которые катализируют различные биохимические процессы (разложение и круговорот веществ) и могут использоваться для оценки качества и здоровья почвы. Ферментативная активность почвы играет решающую роль в формировании и деградации органического вещества почвы, а также в круговороте питательных веществ (C, N и P) [21]. Они тесно связаны с физико-химическими свойствами почвы (такими как pH почвы, влажность и температура почвы, почвенный агрегат и органическое вещество почвы) и микробной биомассой почвы [20,24]. Ферментативное действие гидролаз и оксидоредуктаз в первую очередь регулирует преобразование различных органических и неорганических питательных веществ, а также скорость минерализации легкодоступных питательных веществ в почве, в то время как почвенные микроорганизмы оказывают определенное влияние на структуру почвы и преобразование питательных веществ в отличие от микроорганизмов вследствие своего метаболизма. Почвенные ферменты проявляют хорошую устойчивость к неблагоприятным условиям [25]. В случае, когда окружающие условия неблагоприятны для жизнедеятельности микроорганизмов, метаболизм почвы может остаться относительно неизменным благодаря внеклеточной ферментативной активности.

Целью данной работы являлось изучение влияния бактерий на ферментативную активность почв экспериментально загрязненных ионами тяжелых металлов: Cd(II), Pb(II) и Cr(VI).

Материалы и методы  исследования

Объекты исследования

Объектами исследований являлись   резистентные к ионам тяжелых металлов Cd(II), Pb(II) и Cr(VI) местные штаммы микроорганизмов Вacillus paralicheniformis 10,   Enterobacter cloacae 5,  Enterobacter ludwigii 11 Bacillus atrophаeus 4 и  Bacillus subtilis 15 изолированные из загрязненных тяжелыми металлами почв отобранных вблизи химических предприятий Кашкадарьинской, Самаркандской и Джиззакской областей Узбекистана [2,3,6].

Культивирование микроорганизмов

Для культивирования местных штаммов В. paralicheniformis 10, E. cloacae 5,  E. ludwigii 11, B. atrophаeus 4 и  B. subtilis 15 использовали  Nutrient Broth  (Hi-media). Встряхивание со скоростью 90 об/мин в течение 24 часов при 28^оС.

Определение активности ферментов

В работе определяли активность каталазы, пероксидазы, полифенолоксидазы и инвертазы. Каталаза участвует при разложении пероксида водорода до молекулярного кислорода и воды, а также при обезвреживании токсичной для организмов перекиси водорода. Пероксидаза (ПО) участвует в окислении органических веществ почвы за счет кислорода перекиси водорода и в процессах гумификации. Полифенолоксидаза (ПФО) катализирует окисление фенолов (моно-, ди-, три-) до хинонов в присутствии кислорода воздуха. Хиноны в соответствующих условиях при конденсации с аминокислотами и пептидами образуют первичные молекулы гуминовой кислоты [5]. Каталазная активность определялась газометрическим методом [1], инвертазная, полифенолоксидазная, пероксидазная – колориметрическим методом [4,7,8].

Постановка опыта в модельной экспериментально загрязненной системе «Почва + Тяжелые металлы + Микроорганизмы»

Отобранную почву для проведения экспериментов в модельной экспериментально загрязненной системе «Почва + Тяжелые металлы + Микроорганизмы» взвешивали по 20 гр и вносили в чашки Петри. Далее чашки Петри с почвой стерилизовали автоклавированием в течение 1 час при 125⁰С. В каждую чашку вносили соответствующие концентрации тяжелых металлов Cd²⁺ (4,1 и 8,2мг/кг почвы), Pb²⁺ (48,0 и 95,9 мг/кг почвы), Cr⁶⁺ (112,04 и 224,08 мг/кг почвы). Соли исследуемых металлов (CdCl₂, Pb(NO₃)₂ и K₂CrO₃) растворяли в дистиллированной воде, стерилизовали на кипящей водяной бане в течение 10 мин и вносили в каждую чашку с почвой после автоклавирования. Влажность почвенных образцов доводили стерильной дистиллированной водой до 60% и поддерживали в течение всего периода эксперимента.  В каждый почвенный образец в стерильных условиях вносили наиболее резистентные штаммы микроорганизмов к ионам тяжелых металлов по 2 мл с титром 10⁸ КОЕ/мл. Контролем служила почвенные пробы, не содержащие ионов металлов, но содержащие исследуемые штаммы микроорганизмов. Длительность эксперимента составляла 3 месяца. 

Результаты и их обсуждение

Ранее нами были изолированы и идентифицированы наиболее устойчивые к ионам тяжелых металлов местные штаммы бактерии [2,3,6, 22,23]. В данной работе была исследована ферментативная активность экспериментально загрязненных ионами тяжелых металлов почв при интродукции эффективных штаммов бактерий В. paralicheniformis 10,   E. cloacae 5,  E. ludwigii 11,  B. atrophаeus 4 и  B. subtilis 15. Известно, что  ферментативная активность – один из показателей здоровья почв. В частности, каталазная активность – один из важных показателей биологической активности почв в связи с участием в окислительно-восстановительных процессах. Высокая активность фермента демонстрирует напряженность энергетических процессов и отражает уровень плодородия, так как связана с содержанием гумуса и синтезом гуминовых кислот. Как видно из рисунка 1, активность каталазы при интродукции в почвенные образцы В. paralicheniformis 10 (контроль) составляет 8,0 мл O₂/г_почвы·час, а при концентрации кадмия 4,1 и 8,2 мг/кг почвы - 6,3 О₂/г_почвы ·час и 4,98 О₂/г_почвы ·час. Следует отметить, что при концентрации кадмия 4,1 мг/кг почвы активность данного фермента ингибируется на 7,5% в сравнении с контролем.

Рисунок 1. Активность почвенных ферментов в экспериментально модельной системе “Почва+Тяжелые металлы+Вacillus paralicheniformis 10”

Следовательно, высокая концентрация кадмия (8,2 мг/кг почвы) ингибирует активность каталазы на 19% в сравнении с контролем.  В варианте с культурой E. ludwigii 11 активность каталазы ингибируется при тех же условиях на 7,2 и 21,8% к контролю. Следует отметить, что активность каталазы была выше при концентрации ионов свинца 48,0 мг/кг почвы при внесении в почвенные образцы Enterobacter cloacae 5 на 7,2% и в варианте с культурой Bacillus atrophаeus 4 при концентрации ионов кадмия 4,1 мг/кг почвы на 3,4% по отношению к контролю (рис.2 и рис. 4).

Известно, что почвенные ферменты, тесно связаны с пролиферацией почвенных микробных сообществ и играют фундаментальную роль в разложении различных веществ [11,14,16]. Разложение катализируется почвенными ферментами, которые разрушают растительные остатки и микробную биомассу и деполимеризуют макромолекулы [11]. Также было отмечено, что активность почвенных ферментов показывает высокую чувствительность к стрессу, вызванному металлами, и обычно используется в качестве функционального индикатора загрязнения ТМ [16].

Как видно из рисунка 2 в экспериментальной модельной системе “Почва+Тяжелые металлы+ Enterobacter cloacae 5” активность почвенных ферментов ПО и ПФО при концентрации ионов свинца – 48 мг/кг почвы и 95,9 мг/кг почвы составляет 7,9 бензох/20 г почвы·4 час и 7,2 мг бензох/20 г почвы·4 час, в то же время в контрольных вариантах эти показатели составляют 9 бензох/20 г почвы·4 час и 8,6 мг бензох/20 г почвы·4 час. А при концентрации ионов хрома 112,04 мг/кг почвы и 224,08 мг/кг почвы активность ПФО ингибируется на 31,4% и 48,8% к контролю. Следует отметить, что активность ПФО остается на уровне контроля (8,6 бензох/20 г почвы·4 час) в варианте “Почва+Тяжелые металлы+ Enterobacter cloacae 5” при концентрации свинца 48,0 мг/кг почвы (8,7 бензох/20 г почвы·4 час) (рис.2).  Окислительные ферменты привлекают внимание исследователей из-за их роли в процессах гумификации. По современным представлениям микробные оксидазы – ПФО и ПО – рассматриваются как катализаторы окисления и полимеризации лигнинов из разлагающихся растительных остатков. Их деятельность служит биохимическим показателем интенсивности процессов гумификации, одной из важнейших экологических функций почвы, связанные с сохранением ее плодородия. Окисление ароматических соединений происходит в почве двумя путями - при участии кислорода воздуха и за счет кислорода из перекиси водорода [12,15,19].  Активность ПФО была более высокой при концентрации ионов хрома 112,04 мг/кг почвы и 224,08 мг/кг почвы при внесении в почвенные образцы E. ludwigii 11. При этих условиях активность фермента снижается на 9% и 26% к контролю (рис.3).

Рисунок 2. Активность почвенных ферментов в экспериментально модельной системе “Почва+Тяжелые металлы+ Enterobacter cloacae 5”

В проведенных лабораторных исследованиях выявлено, что увеличение концентрации ТМ (Cd,  Pb, Cr)  отрицательно влияет на активность почвенной инвертазы (рис.1 – рис.5) Наибольшее снижение активности инвертазы было зафиксировано при высоких концентрациях Cr в вариантах с Enterobacter cloacae 5 (42,6%) и Bacillus atrophаeus 4 (49%) по сравнению с контролем (рис.2, рис.4).

Рисунок 3. Активность почвенных ферментов в экспериментально модельной системе “Почва+Тяжелые металлы+ Enterobacter ludwigii 11”

Рисунок 4. Активность почвенных ферментов в экспериментально модельной системе “Почва+Тяжелые металлы+Bacillus atrophаeus 4”

Рисунок 5. Активность почвенных ферментов в экспериментально модельной системе “Почва+Тяжелые металлы+ Bacillus subtilis 15”

Заключение

Таким образом, в настоящее время стало более важным выявление причин загрязнения почв в сельскохозяйственных регионах для содействия устойчивому сельскому хозяйству и обеспечению продовольственной безопасности. Ферментативная активность широко используется для оценки воздействия загрязнения почв ТМ. В результате проведенных исследований в экспериментальной модельной системе «Почва+Тяжелые металлы +Микроорганизмы» наиболее распространенная ферментативная активность (каталазная, полифенолоксидазная, пероксидазная, инвертазная) почв показывает различные реакции на загрязнение ТМ, включая уменьшение, увеличение или отсутствие изменений.

Список литературы:

1. Галстян А.Ш. Итоги изучения биологической активности почв // Итоги научно-исслед. работ по генезису, биохимии, мелиорации, агрохимии и эрозии почв. –Ереван, 1983. – С.41–59.
2. Закирьяева С.И., Усманкулова А.А., Атаджанова Ш.Ш., Пайзиллоев А.К., Кадырова Г.Х. Cкрининг почвенных микроорганизмов резистентных к ионам кадмия и свинца // International scientific conference of young scientists“ Science and Innovation-2021” Tashkent 2021, P-67-69.
3. Кадырова Г.Х., Усманкулова А.А., Закирьяева С.И., Каримов Х.Н., Пайзиллоев А.К., Атаджанова Ш.Ш. Скрининг устойчивых к ионам тяжелых металлов почвенных микроорганизмов // Науч.журн. Universum: химия и биология. 2021. 12(90). С.11-18. https://7universum.com/pdf/nature/12(90)/12(90_1).pdf
4. Карагiна ЛА, Мiхайлоўская НА. Вызначэнне актыўнасцi полiфенолаксiдазы i пераксiдазы у глебе. Весці Акадэміі навук БССР. Серыя сельскагаспадарчых навук. 1986; 2:40–41.
5. Ковриго В.П., Ковриго В.П., Кауричев И.С., Бурлакова Л.М. Почвоведение с основами геологии. – M.:Колос, 2000. – 416 c.
6. Усмонкулова А.А., Кадырова Г.Х., Садуллаева М.С., Нармухаммедова М.К., Кадирова А.Ф., Шонахунов Т.Э. Морфологические и биохимические особенности бактерий при стрессе тяжелых металлов// «Universum: Xимия и биология», Выпуск: 12(102), –2022, Часть 1. C. 31-37.
7. Хазиев Ф.Х., Агафарова Я.М., Гулько А.Е. Ускоренный колориметрический метод определения инвертазной активности почв // Почвоведение. – 1988. – № 11.– С.119–12
8. Хазиев Ф.Х. Методы почвенной энзимологии. – М.:Наука, 1990. –186 с.
9. Ahmad, W., Alharthy, R.D., Zubair, M. et al. Toxic and heavy metals contamination assessment in soil and water to evaluate human health risk. Sci Rep 11, 17006 (2021). https://doi.org/10.1038/s41598-021-94616-4
10. Briffa J, Sinagra E, Blundell R. Heavy metal pollution in the environment and their toxicological effects on humans. Heliyon. 2020 Sep 8;6(9):e04691. doi: 10.1016/j.heliyon.2020.e04691.
11. Chen J., Luo Y., Groenigen K.J., Hungate B.A., Cao J., Zhou X., Wang R. A keystone microbial enzyme for nitrogen control of soil carbon storage. Sci. Adv. 2018; 4:eaaq1689. doi: 10.1126/sciadv.aaq1689.
12. Falade A.O., Nwodo U.U., Iweriebor B.C., Green E., Mabinya L.V., Okoh A.I. Lignin peroxidase functionalities and prospective applications. Microbiologyopen. 6, 1, e00394 (2017). https://doi.org/10.1002/mbo3.394
13. Haiyan Xu, Guimin Liu, Xiaodong Wu, Joseph M. Smoak, Cuicui Mu, Xiaoliang Ma, Xiaolan Zhang, Hongqin Li, Guanglu Hu, Soil enzyme response to permafrost collapse in the Northern Qinghai-Tibetan Plateau, Ecological Indicators, Volume 85, 2018, Pages 585-593, https://doi.org/10.1016/j.ecolind.2017.11.013.
14. Iannelli R., Bianchi V., Macci C., Peruzzi E., Chiellini C., Petroni G., Masciandaro G. Assessment of pollution impact on biological activity and structure of seabed bacterial communities in the Port of Livorno (Italy) Sci. Total Environ. 2012; 426:56–64. doi: 10.1016/j.scitotenv.2012.03.033.
15. Johnsen A., Schmidt S., Hybholt T., Henriksen S., Sidsel; Jacobsen C., Andersen O. Strong impact on the polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH)-degrading community of a PAH-polluted soil but marginal effect on PAH degradation when priming with bioremediated soil dominated by mycobacteria. In: Applied and Envir. Microbiol. 73, 5, 03 (2007). https://doi.org/10.1128/AEM.02236-06
16. Liu Y.M., Cao W.Q., Chen X.X., Yu B.G., Lang M., Chen X.P., Zou C.Q. The responses of soil enzyme activities, microbial biomass and microbial community structure to nine years of varied zinc application rates. Sci. Total Environ. 2020; 737:140245. doi: 10.1016/j.scitotenv.2020.140245.
17. Malla MA, Dubey A, Yadav S, Kumar A, Hashem A, Abd Allah EF. Understanding and Designing the Strategies for the Microbe-Mediated Remediation of Environmental Contaminants Using Omics Approaches. Front Microbiol. 2018 Jun 4; 9:1132. doi: 10.3389/fmicb.2018.01132.
18. Miglani R, Parveen N, Kumar A, Ansari MA, Khanna S, Rawat G, Panda AK, Bisht SS, Upadhyay J, Ansari MN. Degradation of Xenobiotic Pollutants: An Environmentally Sustainable Approach. Metabolites. 2022 Aug 31;12(9):818. doi: 10.3390/metabo12090818.
19. Naumov V.D., Microorganism activity depending on soil conditions in an irrigated garden /V. D. Naumov, F. N. Rykalin // Izvestiya Samarskoi GSHA. 4, (2010).
20. Qi R., Li J., Lin Z., Li Z., Li Y., Yang X., Zhang J., Zhao B. Temperature effects on soil organic carbon, soil labile organic carbon fractions, and soil enzyme activities under long-term fertilization regimes Appl. Soil Ecol., 102 (2016), pp. 36-45.
21. Song, Y., Song, C., Yang, G., Miao, Y., Wang, J., Guo, Y., 2012. Changes in labile organic carbon fractions and soil enzyme activities after marshland reclamation and restoration in the Sanjiang Plain in Northeast China. Environ. Manag. 50, 418–426. https://doi.org/10.1007/s00267-012-9890-x
22. Usmonkulova AA, Kadirova GKH, Khusanov TS, Shonakhunov TE, Shukurov N (2024). Determination of local bacteria synthesizing acc deaminase on plant growth indicators under nickel and cadmium stress conditions. SABRAO J. Breed. Genet. 56(5): 2033-2044. http://doi.org/10.54910/sabrao2024.56.5.26.
23. Usmonkulova A.A., Kadirova G.Kh., Mardonov I.H., Khalilov I.M., Abdullaev A.K.Screening of bacteria of the genus Bacillus resistant to various concentrations of heavy metal ions Cu²⁺, Co²⁺, Cd²⁺ and Pb²⁺  // Uzbek biological journal,  Тashkent, 1/2022. P-27-32.
24. Yin, M. Zhang, C. Gao, X. Yang, Y. Xu, P. Wu, H. Zhang Salinity evolution of coastal soils following reclamation and intensive usage, Eastern China Environ. Earth Sci., 75 (2016), pp. 1-11.
25. Ying Zhang, Yang Hu, Ning An, Duo Jiang, Bo Cao, Zhao Jiang, Yiwen Yan, Chenshu Ming, Qingjuan Meng, Wei Han, Short-term response of soil enzyme activities and bacterial communities in black soil to a herbicide mixture: Atrazine and Acetochlor, Applied Soil Ecology, Volume 181, 2023, 104652, https://doi.org/10.1016/j.apsoil.2022.104652.