ГЕНОТОКСИЧЕСКИЙ, ОКСИДАТИВНЫЙ И БАКТЕРИЦИДНЫЙ ЭФФЕКТЫ ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА ГЕМЦИТАБИНА

АННОТАЦИЯ

Исследован генотоксический, оксидативный и бактерицидный эффекты препарата гемцитабина, обладающего высокой терапевтической эффективностью при лечении широкого спектра опухолей с использованием люкс-биосенсоров E.coli pRecA-lux, pColD-lux, pSoxS-lux, pKatG-lux. Выявлен высокий уровень генотоксичности гемцитабина, который проявляется нарушением структуры наследственного материала, внося одно- и двуцепочечные разрывы молекулы ДНК. Высокие концентрации гемцитабина показывают бактерицидный эффект на всех использованных в исследовании штаммах уже при концентрациях 2,4316×10^-6 М и 4,8632×10^-7 М, что проявляется снижением уровня люминесценции как факт бактерицидного действия препарата. Гемцитабин не оказал видимого эффекта на штаммы pKatG-lux и pSoxS-lux, что говорит об отсутствии у данного препарата способности повышать оксидативный стресс.

ABSTRACT

The genotoxic, oxidative and bactericidal effects of gemcitabine, a drug with high therapeutic efficacy in the treatment of a wide range of tumors, were studied using the lux biosensors E. coli pRecA-lux, pColD-lux, pSoxS-lux, pKatG-lux. A high level of genotoxicity of gemcitabine was revealed, which manifests itself in a violation of the structure of the hereditary material, introducing single- and double-strand breaks in the DNA molecule. High concentrations of gemcitabine show a bactericidal effect on all strains used in the study already at concentrations of 2.4316 × 10-6 M and 4.8632 × 10-7 M, which is manifested by a decrease in the luminescence level as a fact of the bactericidal effect of the drug. Gemcitabine did not have a visible effect on the strains pKatG-lux and pSoxS-lux, which indicates that this drug does not have the ability to increase oxidative stress.

Ключевые слова: Люкс-штаммы E.coli, генотоксичность, бактерицидность, гемцитабин.

Keywords: Lux strains of E.coli, genotoxicity, bactericidal activity, gemcitabine.

Гемцитабин как противораковый аналог пиримидинового нуклеозида обладает высокой терапевтической эффективностью при лечении широкого спектра опухолей. Гемцитабин активируется в опухолевых клетках путем последовательного фосфорилирования. Фермент дезоксицитидинкиназа превращает гемцитабин в два активных метаболита — ди- и трифосфат. Дифосфатные нуклеозиды подавляют фермент рибонуклеотидредуктазу, а трифосфаты конкурируют за включение в цепь ДНК, а также могут встраиваться в РНК. Подобные процессы приводят к ингибированию репликации, восстановления ДНК и к апоптозу. Несмотря на то, что гемцитабин проявляет в высокой степени гематологическую токсичность [6, 7, 9], препарат обладает высоким терапевтическим эффектом и широко применяется при лечении различных форм опухолей [6, 10, 11].

В настоящее время пришло понимание того, что генотоксичность лекарственных препаратов приводит не только к онкологическим патологиям, но и нарушениям других систем человека: сердечно-сосудистой, нейродегенеративной, респродуктивной, старения и др., что требует тщательного исследования лекарственных препаратов на генотоксичность и мутагенность с использованием валидизированных систем тестирования [3]. Исследование генотоксичности лекарственных препаратов дает возможность к прогнозированию возможных последствий его воздействия на организм.

Целью нашего исследования является изучение генотоксического, оксидативного и бактерицидного эффектов лекарственного препарата гемцитабина, применяемого при химиотерапии, с использованием бактериальной тест-системы на основе люкс-биосенсора E.coli

Материалы и методы исследования.

Бактериальные штаммы lux-биосенсоров. В исследованиях использовался метод lux-test и 4 штамма люминесцирующих lux-биосенсоров (табл. 1). Штаммы были получены путем трансформации Escherichia coli MG1655 гибридными плазмидами pRecA-lux, pColD-lux, pSoxS-lux, pKatG-lux [4]. Штаммы lux-биосенсоров любезно предоставлены д-р биол. наук, проф. Абилевым С.К. (ИОГен им. Н.И. Вавилова, Москва).

Таблица 1.

Люминесцирующие штаммы E.coli и область применения

В роли генов-репортеров в данных lux-биосенсорах использованы гены luxCDABE, которые были изолированы из ДНК энтомопатогенных светящихся бактерий Photorhabdus luminescens ZM1.

В качестве положительных контролей (k+) для индукции SOS-ответа в клетках бактерий для lux-биосенсоров Е.coli MG1655 (pRecA-lux) и E.coli MG1655 (pCoD-lux) использовался антибактериальный препарат диоксидин, который вносит разрывы в ДНК. Для индукции окислительного стресса в штаммах E.coli MG1655 (pKat–lux) и Е.coli MG1655 (pSoxS–lux) была использована перекись водорода, которая индуцирует окислительный стресс (табл. 2). В качестве отрицательного контроля (k-) использовалась дистиллированная вода.

Таблица 2.

Положительные контроли в исследовании

Исследовали препарат гемцитабин-эбеве (Фарева Унтерах ГмбХ, Австрия) на различные концентрации до 8 разведений – от 3,7994×10^-2 до 4,8632×10^-7 М

Питательная среда. Штаммы Escherichia coli культивировали в бульоне Луриа-Бертани (LB): пептон – 10 г, дрожжевой экстракт – 5 г, NaCl – 10 г/л раствора; рН – 7.0, 100 мкг/мл ампициллина.

Метод биолюминесценции. Lux-test - измерение биолюминесценции lux-биосенсоров в присутствии противоопухолевого препарата, (k+) и (k-). Культуры штаммов lux-биосенсоров выращивали до экспоненциальной фазы в жидкой среде LB в 10-17 ч. (ночная культура). Ночную культуру разводили в свежем LB бульоне с использованием денситометра DEN-1 («BioSan») до плотности, которая соответствует 1 единице МакФарланда, при которой можно регистрировать максимальный отклик при воздействии на lux-штамм индуктором (k+). После этого культуры с плотностью 1 МакФарланда разбавляли в 10 раз, тем самым получая плотность культур 10⁷ клеток/мл - 0.1 МакФарланда, и далее инкубировали при 37^оC в течение 2-х часов на качалке с целью аэрации культуры. Затем пробы культур по 180 мкл вносили в лунки 96-луночного планшета, затем добавляли по 20 мкл (k-), (k+) и исследуемый препарат. Далее, культивировали при 37^оC в течение: E.coli MG1655 (pRecA-lux) и E.coli MG1655 (pSoxS-lux) – 60 мин.; E.coli MG1655 (pColD-lux) – 90 мин.; E.coli MG1655 (pKatG-lux) – 45 мин.

Уровень люминесценции определяли на микропланшетном люминометре Luminometer photometer LM 01A (IMMUNOTECH s.r.o, Czech Republic) в соответствии с инструкцией к прибору и выражали в относительных световых единицах (RLU).

Фактор индукции (R) определяли, как отношение интенсивности люминесценции культуры lux-биосенсора, содержащей исследуемый препарат (I_ind), к интенсивности люминесценции контрольной культуры lux-биосенсора (I₀): R = I_ind /I₀.

Результаты исследования. Результаты исследования генотоксичности, бактерицидности и окислительного стресса гемцитабина продемонстрированы на рис. 1-4. Штамм pRecA-lux реагирует на действие препарата гемцитабина с концентрации 3,7994×10^-2 М до 1,2158×10^-5М.

Рисунок 1. Люминесцентный ответ штамма pRecA-lux на гемцитабин

Наблюдается генотоксичное действие гемцитабина, пик которого отмечается при концентрации 1,52×10^-3М (R= 1,198, для диоксидина был 1,59). Пик генотоксичности гемцитабина на штамме pRecA-lux выявлен при коонцентрации1,52×10^-3 М (R = 1,198).  Бактерицидное действие начиналось с концентрации 2,4316×10^-6 М (R=0,957) и 4,8632×10^-7 М (R=0,961) (рис. 1).

Рисунок 2. Люминесцентный ответ штамма pColD-lux на гемцитабин

На штамме pColD-lux все концентрации гемцитабина оказали слабое бактерицидное действие (рис. 2), так, максимальный эффект отмечен при концентрации 3,7994×10^-2 М (R = 0,668).

Рисунок 3. Люминесцентный ответ штамма pKatG-lux на гемцитабин

Рисунок 4. Люминесцентный ответ штамма pSoxS-lux на гемцитабин

На штаммы, регистрирующие окислительный стресс: pKatG-lux и pSoxS-lux, был также оказан гемцитабином бактерицидный эффект (рис. 3 и 4). При этом наиболее наибольший эффект отмечался при самой низкой концентрации (4,8632×10^-7 М, R=0,679).

Обсуждение. Для исследования генотоксического действия лекарственного препарата, связанного с повреждениями (разрывами) молекулы ДНК были использованы lux-биосенсоры E.coli MG1655 (pCoD-lux) и E.coli MG1655 (pRecA-lux). Для этих биосенсоров, реагирующих на вещества, повреждающие ДНК использовались SOS-промоторы PcolD и PrecA, соответственно. SOS-промотор PcolD был изолирован из плазмиды pColD-EC23, содержащей ген colD, который кодирует синтез колицина ColD, PrecA изолирован из генома Escherichia coli. Эти промоторы активируются лишь при повреждениях в молекулах ДНК [Manukhov I.V. 2007]. В ряде наших работ исследованы лекарственные препараты химиотерапевтического ряда и показано, что люкс-биосенсоры эффективно выявляют генотоксические, оксидативные и бактерицидные свойства изучаемых групп соединений [1, 2].     Полученные в данной работе результаты отражают высокий уровень генотоксичности препарата, начиная уже с низких концентраций. Причем, уровень его генотоксичности сравним с k+ – диоксидином, известного мутагена. При увеличении концентрации гемцитабина (2,4316×10^-6 М (R=0,957) и 4,8632×10^-7 М) отмечается снижение уровня люминесценции, что является фактом бактерицидного действия препарата.

В исследованиях также использовались lux-биосенсоры, специфически реагирующие на повышение уровня в среде веществ, которые вызывают индукцию в клетках E.coli окислительного стресса. Для определения индукторов окислительного стресса (образующих в клетке гидроксильный радикал (OH^-), активные формы кислорода (O₂^-), перекись водорода (H₂O₂)), были использованы промоторы PsoxS и PkatG. Геном katG кодирует синтез каталазы, который разлагает перекись водорода на воду и кислород. [8].

Промотор PkatG (с белком-активатором OxyR) специфически реагирует на перекись водорода и на различные органические пероксиды. Промотор PsoxS (с белком-активатором SoxR) специфически реагирует на активные формы кислорода. Биосенсоры с промоторами PkatG и PsoxS фиксируют наличие в среде окислителей, образующих в клетке гидроперекиси и активные формы кислорода [8].

На штаммы, регистрирующие окислительный стресс: pKatG-lux и pSoxS-lux, был также оказан гемцитабином как генотоксичный, так и бактерицидный эффект. Нами на штамме pRecA-lux у гемцитабина, зафиксирована концентрация с генотоксичным эффектом. Однако, подобного эффекта мы не наблюдаем на штамме pColD-lux. Предположительно, высокая чувствительность штамма pColD-lux к гемцитабину приводит к гибели бактериальных клеток, что проявляется низким уровнем люминесценции.

Заключение. Результаты проведенного исследования выявили высокий уровень генотоксичности у лекарственного препарата гемцитабин, который проявляется нарушением структуры наследственного материала, внося одно- и двуцепочечные разрывы молекулы ДНК. Высокие концентрации гемцитабина показывают бактерицидный эффект на всех использованных в исследовании штаммах уже при концентрациях 2,4316×10^-6 М и 4,8632×10^-7 М, что проявляется снижением уровня люминесценции как факт бактерицидного действия препарата. Гемцитабин не оказал видимого эффекта на штаммы pKatG-lux и pSoxS-lux, что говорит об отсутствии у данного препарата способности повышать оксидативный стресс.

Список литературы:

1. Гурбанов Р.Г. Определение генотоксичности и бактерицидности пентахлорфенола на люкс-биосенсорах E.coli. / Гурбанов Р.Г., Доднаева Л.Р., Джамбетова П.М.  //Известия Чеченского государственного университета им. А.А. Кадырова, 2023. -9 № 3 (31). - С. 26-30.
2. Гурбанов Р.Г Скрининг препарата паклитаксел на генотоксичность и окислительный стресс. /Гурбанов Р.Г., Джамбетова П.М., Бисултанова З.И., Доднаева Л.Р. // Естественные и технические науки, 2024. - № 5 (192). - С. 61-64.
3. Дурнев А.Д. Актуальные аспекты генетической токсикологии лекарственных средств. Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения. /Дурнев А.Д., Жанатаев А.К. //Регуляторные исследования и экспертиза лекарственных средств, 2022. - №12(1). - №90-109.
4. Котова В.Ю. Индуцируемые специфические lux-биосенсоры для детекции антибиотиков: конструирование и основные характеристики. /Котова В.Ю., Рыженкова К.В., Манухов И.В., Завигельский Г.Б. //Прикладная биохимия и микробиология, – 2014. – Т. 50. – № 1. – С. 112–117
5. Матвеев В.Б. Гемцитабин (Цитогем®) в лечении распространенного переходно-клеточного рака мочевого пузыря. /Матвеев В.Б., Волкова М.И. //Онкоурология, 2008. - № 4. - С. 74-79.
6. Ashrafizadeh M. Acquired and intrinsic gemcitabine resistance in pancreatic cancer therapy: Environmental factors, molecular profile and drug/nanotherapeutic approaches. / Ashrafizadeh M, Luo K, Zhang W, Reza Aref A, Zhang X. //Environ Res. 2024. – № 240(Pt 2):117443. doi: 10.1016/j.envres.2023.117443.
7. Horino T. Gemcitabine-induced renal thrombotic microangiopathy. /Horino T, Inotani S, Ishihara M, Terada Y. //Nephrology (Carlton). 2022. – №27(8). – P. 724-725. doi: 10.1111/nep.14043.
8. Manukhov I.V. Action of 1,1–dimethylhydrazine on bacterial cells is determined by hydrogen peroxide. /Manukhov I.V., Kotova V.Yu., Zavilgelsky G.B. //Mutation Res. – 2007. – V. 634. – P. 172–176.
9. Miao H. Small Molecular Gemcitabine Prodrugs for Cancer Therapy. / Miao H, Chen X, Luan Y. //Curr. Med Chem. 2020. – №27(33). – P.5562-5582. doi: 10.2174/0929867326666190816230650.
10. O'Reilly EM. Flashback Foreword: Gemcitabine for Advanced Pancreatic Cancer. / O'Reilly EM, Ko AH, Friedberg JW. //J Clin Oncol. 2023. – №41(36). – P. 5479-5480. doi: 10.1200/JCO.23.01895.
11. Pandit B. Recent Development of Prodrugs of Gemcitabine. / Pandit B, Royzen M. //Genes (Basel), 2022. – №13(3). – P.466. doi: 10.3390/genes13030466.