ВЛИЯНИЕ МЕСТНЫХ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ РОДА Bacillus, Azotobacter, Azospirillium И ЦИАНОБАКТЕРИЙ Nostoc И Anabaena НА РОСТ И РАЗВИТИЕ ХЛОПЧАТНИКА СОРТА C-6524

АННОТАЦИЯ

В этой работе изучено влияние местных штаммов бактерий рода Bacillus, Azotobacter, Azospirillium и цианобактерий Nostoc и Anabaena на рост и развитие хлопчатника сорта C-6524, а также продукции фитогормонов микроорганизмами. Установлено, что в контрольном варианте средняя длина стебля хлопчатника составила 9,97 см, длина корня - 6,4 см. Выявлено, что длина стебля хлопчатника инокулированной N. calcilola 32 и A. brasilense 4-13 составляет 17,5 см и 17,1 см, соответственно. У остальных использованных в эксперименте штаммов — A. chroococcum 44, B. subtilis CKB256, B. thuringiensis 93 и B. thuringiensis 1fo — наблюдалось увеличение длины стебля хлопчатника на 16,8 см, 14,0 см, 15,8 см и 14,1 см, соответственно. Следует отметить, что в результате стимуляции роста растений штаммом A. chroococcum 44 по сравнению с контролем установлено, что влажная биомасса стебля хлопчатника была в 3,4 раза выше, а масса корня - в 2,67 раза. Выявлено, что B. thuringiensis 93, A. chroococcum 44 и A. brasilense 13-4 синтезируют наибольшее количество ИУК на вторые сутки культивирования. Следовательно, культуры B. thuringiensis 93, A.chroococcum 44 и  A. brasilense 13-4 продуцируют ИУК в концентрации 508,5 мкг/мл, 502,0 мкг/мл и 490,8 мкг/мл, соответственно. Установлено, что в присутствии в культуральной среде L-Триптофана в концентрации 1 мг/мл, увеличивает синтез ИУК у N.calcicola 32 и A.variabilis 28  в течение 7 суток культивирования на 54,4% и 49,3%, соотвественно.  

ABSTRACT

In this work, the influence of local strains of bacteria of the genus Bacillus, Azotobacter, Azospirillium and cyanobacteria Nostoc and Anabaena on the growth and development of cotton variety C-6524, as well as the production of phytohormones by microorganisms, was studied. It was found that in the control variant the average length of the cotton stem was 9.97 cm, the length of the root was 6.4 cm. The stem length of cotton plants inoculated with N. calcilola 32 and A. brasilense 13-4 was found to be 17.5 cm and 17.1 cm, respectively. The remaining strains used in the experiment — A. chroococcum 44, B. subtilis CKB256, B. thuringiensis 93, and B. thuringiensis 1fo — were observed to increase the length of the cotton stem by 16.8 cm, 14.0 cm, 15.8 cm, and 14.1 cm, respectively. It should be noted that as a result of stimulating plant growth with the strain A. chroococcum 44, compared to the control, it was found that the wet biomass of the cotton stem was 3.4 times higher, and the root mass was 2.67 times higher. It was found that B. thuringiensis 93, A. chroococcum 44 and A. brasilense 13-4 synthesize the largest amount of IAA on the second day of cultivation. Therefore, B. thuringiensis 93, A. chroococcum 44 and A. brasilense 13-4 cultures produce IAA at concentrations of 508.5 μg/ml, 502.0 μg/ml and 490.8 μg/ml, respectively. It was established that in the presence of L-Tryptophan in the culture medium at a concentration of 1 mg/ml, it increases the synthesis of IAA in N.calcicola 32 and A.variabilis 28 during 7 days of cultivation by 54.4% and 49.3%, respectively.

Ключевые слова: Bacillus, Azospirillium, Azotobacter, Nostoc, Anabaena, стимуляция, рост, фитогормоны, гиббереллин, ауксин, хлопчатник

Keywords: Bacillus, Azospirillium, Azotobacter, Nostoc, Anabaena, stimulation, growth, phytohormones, gibberellin, auxin, cotton

Введение

Быстрое сокращение естественных экосистем за последние столетия и серьезные климатические изменения наряду с растущим антропогенным давлением привели к более частым экстремальным погодным явлениям, более высоким темпам деградации земель и потенциальной потере среды обитания. Кроме того, чрезмерное использование удобрений отрицательно влияет на здоровье почвы. Таким образом, необходимы корректирующие меры для предотвращения деградации земель, на которых производится 98% продовольствия в мире.  Состояние мировых земельных и водных ресурсов для продовольствия и сельского хозяйства связано с продуктивностью земель и экосистем и отражает проблемные тенденции в потреблении ресурсов [1]. Также большинство сельскохозяйственных земель характеризуются загрязнением тяжелыми металлами, органическими загрязнителями, сильным подкислением или подщелачиванием, высокой соленостью, ограниченным количеством воды и т. д. [2,3].  Увядание и опадение листьев, уменьшение участков листьев и снижение потери воды через транспирацию – все это физиологические реакции растений на стресс. Снижение давления тургора в условиях стресса является одним из самых тонких физиологических механизмов, который позволяет клеткам развиваться в стрессовой среде. Сельскохозяйственные почвы, прямо или косвенно, постоянно теряют свои качественные и физические свойства (текстуру почвы, проницаемость, пористость и дренаж), а также свое химическое (дисбаланс питательных элементов) и биологическое (полезные организмы) здоровье [4]. В случае с почвенной микробиотой некоторые авторы показали, что различные пестициды могут снижать численность и разнообразие микробиоты, что приводит к ухудшению ее функционирования в агросистемах [5,6]. Следует отметить, что интродукция микробных препаратов в почву может реструктурировать и стимулировать механизмы, способствующие росту растений, как в оптимальных условиях, так и при различных типах биотического и абиотического стресса [7]. Так как в любой естественной или сельскохозяйственной экосистеме растения взаимодействуют с почвенными микроорганизмами [8,9]. Подавляющее большинство этих взаимодействий, будь то патогенные, нейтральные или полезные, происходит через сложную сеть сигналов, которые включают метаболиты, летучие и нелетучие соединения [10], физические взаимодействия и взаимодействия, которые регулируют экспрессию генов, либо увеличивая, либо подавляя ее [10,11]. Важно использовать эту сложную сеть естественных взаимодействий для создания искусственных микробных консорциумов, которые существенно и последовательно приносят пользу росту и здоровью растений, увеличивают урожайность и уменьшают использование химических удобрений.

Исходя из вышесказанного, целью исследования является  изучение влияния местных штаммов бактерий рода Bacillus, Azotobacter, Azospirillium и цианобактерий Nostoc и Anabaena на рост и развитие хлопчатника сорта C-6524, а также продукции фитогормонов микроорганизмами.

Материалы и методы

Объекты исследования.

Объектом исследования являются местные штаммы микроорганизмов из почвенных образцов и изолированные из ризосферы сельскохозяйственных растений Bacillus  thuringiensis 93, Bacillus  thuringiensis 1фо, B. subtilis CKB256,  Azotobacter chroococcum 44, Azospirillium brasilense UT13-4, Nostoc calcicolа 32 и  Anabaena variabilis 28 [12-14].

Питательные среды и условия культивирования.

Для культивирования бактерий Bacillus thuringiensis использовали МПБ и питательную среду c добавлением пептона (состав, г/л: глюкоза – 5; NaCl- 0,5; K₂HP0₄ – 0,5; MgS0₄ – 0,2; пептон – 10) в течение 16-17 часов при температуре 28-30°С [15]. Культуры выращивали на качалке в течение 20 час при температуре 28-30°С в колбах объемом 250 мл. Цианобактерии выращивали на минеральной среде «BG-11₀» без азота [16], в люминостате при 1500 – 2000 лк в течение 5 сут с барботированием смесью воздуха и углекислого газа. Для культивирования A. chroococcum 44 использовали питательную среду «Эшби» [17]. Культуры выращивали в течение 3 сут на качалке при 37°С в колбах объемом 250 мл. A. brasilense UT13-4 выращивали на картофельной среде (в г/л): экстракт получали из 200 г картофеля на 1 л среды, в состав которой входили малат – 2,5; нерафинированный сахар – 2,5; биотин – 100 мкг/л среды; пиридоксин – 200 мкг/л среды и pH 7,0. Бактерии выращивали в течение 3 дней при температуре 28°C [18].

Вегетационные опыты

В экспериментах использовали калиброванные семена хлопчатника сорта C-6524 с всхожестью не менее 92%. Отобранные здоровые семена одинакового размера подвергали поверхностной стерилизации в течение десяти минут в 1% растворе гипохлорита натрия. После стерилизации семена промывали в дистиллированной воде. Семена выращивали в водопроводной воде. Проросшие семена высевали в пластиковые горшки диаметром 17 см и глубиной 10 см с почвой интродуцированный суспензией активной культуры. Примеры:

Т1. Контроль

Т2. A. chroococcum 44 + семена хлопчатника

Т3. A. brasilense UT13-4+ семена хлопчатника

Т4. B. subtilis CKB256+ семена хлопчатника

Т5. N. calcicola 32 + семена хлопчатника

Т6.  A. variabilis 28 + семена хлопчатника

Т7. B. thuringiensis 93 + семена хлопчатника

Т8. B. thuringiensis 1fo + семена хлопчатника

Растения в каждом горшке собирали через 20 дней. Частицы почвы удаляли из корней растений дистиллированной водой. С помощью электронных аналитических весов (EP214C 224S-CW, Швейцария) измеряли длину стебля и корня, а также влажную биомассу. После сушки в сушильном шкафу при температуре 70°С в течение 5-6 суток образцы сухой массы корней и стеблей взвешивали для измерения их массы [19,20].

Продуцирование фитогормонов

Продуцирования индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) проводили по следующей схеме: бактериальную культуру с титром 4,1∙10⁶ инокулировали в соответствующую питательную среду. Культивирование проводили при 28⁰С в течении 1, 2 и 3 дней. ИУК продуцирующую активность цианобактерий проводили в течение 3 и 7 дней культивирования в присутствии L-триптофана в концентрации 1 мг/мл. Культуры центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 мин. 2 мл супернатанта смешивали с 8 мл реагента Сальковского (50 мл, 35% HClO₄; 1мл  0,5 М FeCl₃ ), после чего через  30 мин показания  оптической плотности  измеряли  при 530 нм  на ФЭК - КФК-2 (Россия) используя зеленый светофильтр [21].  Образование розового цвета, показывает синтез ИУК. Концентрацию ИУК вычисляли по калибровочной кривой построенный по стандартным значениям ИУК (Sigma).

Синтез гиббереллина бактериями определяли в течение 3 и 7 дней согласно спектрофотометрическому методу, рекомендованному Berrios et al. (2004) [22].

Эксперименты проводились в 3-х повторности. Полученные данные статистически обработаны с помощью компьютерных программ (Excel) статистического анализа.

Результаты и их обсуждение

В микровегетационных экспериментах по выращиванию хлопчатника сорта C-6524 изучалось влияние инокуляции семян растений штаммами A.chroococcum 44, A. brasilense UT13-4,  B. subtilis CKB256, N. calcicolа 32, Anabaena variabilis 28, B. thuringiensis 93 и B. thuringiensis 1fo на коэффициент прорастания, скорость роста и энергию прорастания. Было выявлено, что исследуемые штаммы увеличивают эти показатели на 25-30% по сравнению с контрольными вариантами. Далее, в вегетационных экспериментах по выращиванию хлопчатника учитывались биометрические показатели (длина корней и стебля) и проводилось ежедневное наблюдение в течение 20 дней. Установлено, что в контрольном варианте средняя длина стебля хлопчатника составила 9,97 см, длина корня - 6,4 см (рис.1; рис.2). Следует отметить, что среди исследованных штаммов по влиянию на рост и развитие надземной части хлопчатника наиболее активными оказались N. calcilola 32 и A. brasilense 4-13 (рис.2). Следовательно, длина стебля хлопчатника инокулированной

Рисунок 1. Влияние ростостимулирующих местных штаммов микроорганизмов на рост и развитие хлопчатника сорта C-6524:

а)  контроль; б)  A. chroococcum 44; в)  A. brasilense 4-13; г) N. calcicola 32; д) B. subtilis CКБ256; е) B. thuringiensis 93

N. calcilola 32 и A. brasilense 4-13 составляет 17,5 см и 17,1 см, соответственно. У остальных использованных в эксперименте штаммов — A. chroococcum 44, B. subtilis CKB256, B. thuringiensis 93 и B. thuringiensis 1fo — наблюдалось увеличение длины стебля хлопчатника на 16,8 см, 14,0 см, 15,8 см и 14,1 см, соответственно. Известно, что микроорганизмы, стимулирующие рост растений (МСРР) – это термин, который применяется ко всем микроорганизмам (например, бактериям, актиномицетам, грибам и водорослям), которые оказывают благотворное влияние на рост растений посредством действия либо прямых, либо косвенных механизмов (например, минеральное питание, снижение уровня этилена, подавление болезней) [23].

Рисунок 2. Морфометрические показатели хлопчатника сорта C-6524 в вегетационных экспериментах инокулированные ростостимулирующими микроорганизмами

После прорастания семена растений непрерывно взаимодействуют с микроорганизмами, которые находятся как под землей, так и над землей. Эти взаимодействия динамичны и изменяются в зависимости от микробной структуры, которая формируется на разных стадиях роста и развития растений.   По сравнению с контролем штаммы B. subtilis CKB256 и B. thuringiensis 93 показали наибольший показатель по увеличению длины корня хлопчатника - 17,67 см и 14,46 см, соответственно. Обработка семян хлопчатника другими исследованными штаммами A. chroococcum 44, A. brasilense 4-13, N. сalcicola 32 и B. thuringiensis 1fo привела к тому, что длина корня растения составила 10,1 см, 11,7 см, 8,2 см и 11см, соответственно. В контрольном варианте средняя влажная биомасса стебля хлопчатника составила 0,83 грамма, масса корня 0,093 грамма. Следует отметить, что в результате стимуляции роста растений штаммом A. chroococcum 44 по сравнению с контролем установлено, что влажная биомасса стебля хлопчатника была в 3,4 раза выше, а масса корня - в 2,67 раза (рис.3).

Далее исследована фитогормон продуцирующая (ИУК, гиббереллин) активность местных ростостимулирующих штаммов микроорганизмов. Как видно из таблицы 1  штаммы B. thuringiensis 93, A.chroococcum 44 и  A. brasilense 13-4 синтезируют наибольшее количество ИУК на вторые сутки культивирования. Следовательно, культуры B. thuringiensis 93, A.chroococcum 44 и  A. brasilense 13-4 продуцируют ИУК в концентрации 508,5 мкг/мл, 502,0 мкг/мл и 490,8 мкг/мл, соответственно (табл.1).

Рисунок 3. Влияние обработки семян хлопчатника сорта С-6524 микроорганизмами на показатели сухой биомассы в вегетационных экспериментах (срок опыта – 20 дней)

Цианобактерии N.calcicola 32 и A.variabilis 28 в течение 7 суток культивирования синтезируют ИУК в концентрации 86,9 мкг/мл и 79,6 мкг/мл (табл.2). Следует отметить, что в присутствии в культуральной среде L-Триптофана в концентрации 1 мг/мл, увеличивает синтез ИУК в течение 7 суток культивирования N.calcicola 32 и A.variabilis 28  на 54,4% и 49,3%, соотвественно.  Известно, что аминокислота триптофан является важнейшим исходным веществом для биосинтеза ауксина.

Таблица 1.

Продуцирование ИУК в динамике роста и развития ростостимулирующими бактериями

Таблица 2.

Продуцирование ИУК в динамике роста и развития ростостимулирующих цианобактерий в присутствии L-Триптофана

ИУК, которая синтезируется некоторыми микроорганизмами, является продуктом метаболического пути L-триптофана. Триптофан обычно является предшественником синтеза ИУК и добавление этой аминокислоты к культурам бактерий приводит к более высокой продукции ИУК [21, 24].  В соответствии таблицы 3, культуры B. thuringiensis 93, B. thuringiensis 1фо, A. chroococcum 44 и A. brasilense 13-4, продуцируют гиббереллин в динамике роста и развития (табл.3).

Таблица 3.

Продуцирование гиббереллина ростостимулирующими бактериями в динамике роста и развития

Аналогично продукции ИУК исследуемыми культурами наибольший синтез гиббереллина соответствует на 2 сутки культивирования. Так, B. thuringiensis 93 A.chroococcum 44 продуцируют  гиббереллин в концентрации 658,5 мкг/мл и 653,5 мкг/мл, соответственно. В работе Kejela, T. (2024), отмечается, что гибберелловая кислота, вырабатываемая некоторыми видами ризобактерий, включая Serratia marcescens и Bacillus licheniformis, увеличивает высоту растений и биомассу у различных сельскохозяйственных культур [25].

Заключение. Способность микроорганизмов синтезировать фитогормоны считается важным механизмом стимуляции роста растений под их влиянием. В частности, ауксин – важный фитогормон, жизненно важный для развития и роста растений. Он влияет на размер побега и корневых меристем, определяет морфогенез цветка и положение зачатков боковых органов.  Инокуляция семян хлопчатника сорта С-6524 местными штаммами бактерий увеличивало массу побега и длину корневой системы по сравнению с контролем, в чем проявлялось их стимулирующее действие на рост растений. Следовательно, исследованные местные штаммы ростостимулирующих микроорганизмов N.calcicola 32,  A.variabilis 28,  A. chroococcum 44, B. thuringiensis 1fo и В. thuringiensis 93 и A. brasilense 13-4, продуцируют фитогормоны, такие как ауксин и гиббереллин. Таким образом, ввыяснение механизмов симбиоза «микроорганизмы-растение» поможет исследователям использовать в будущем новые перспективные штаммы в сельском хозяйстве.

Список литературы:

1. FAO (2022). The state of the world’s land and water resources for food and agriculture – systems at breaking point (Rome, Italy: FAO). doi: 10.4060/cb9910en
2. Jiang, C., Guan, K., Khanna, M., Chen, L., Peng, J. (2021). Assessing marginal land availability based on land use change information in the contiguous united states. Environ. Sci. Technol. 55, 10794–10804. doi: 10.1021/acs.est.1c02236
3. Shahane, A. A., Shivay, Y. S. (2021). Soil health and its improvement through novel agronomic and innovative approaches. Front. Agron. 3. doi: 10.3389/fagro.2021.680456
4. Tilman, D.; Cassman, K.G.; Matson, P.A.; Naylor, R.; Polasky, S. Agricultural sustainability and intensive production practices. Nature 2002, 418, 671–677.
5. Gomiero, T.; Pimentel, D.; Paoletti, M.G. Is There a Need for a More Sustainable Agriculture? CRC Crit. Rev. Plant Sci. 2011, 30, 6–23.
6. Singh, U.; Walvekar, V.A.; Sharma, S. Microbiome as Sensitive Markers for Risk Assessment of Pesticides. In Pesticides in Crop Production; Wiley: Hoboken, NJ, USA, 2020; pp. 89–108.
7. Woo, S.L.; Pepe, O. Microbial Consortia: Promising Probiotics as Plant Biostimulants for Sustainable Agriculture. Front. Plant Sci. 2018, 9, 1801.
8. Hartmann, A.; Schmid, M.; van Tuinen, D.; Berg, G. Plant-driven selection of microbes. Plant. Soil 2009, 321, 235–257.
9. Alsanius, B.W.; Karlsson, M.; Rosberg, A.K.; Dorais, M.; Naznin, M.T.; Khalil, S.; Bergstrand, K.J. Light and microbial lifestyle: The impact of light quality on plant–microbe interactions in horticultural production systems—A review. Horticulturae 2019, 5, 41.
10. León, R.H.; Solís, D.R.; Pérez, M.C.; Mosqueda, M.C.d.C.; Rodríguez, L.I.M.; la Cruz, H.R.d.; Cantero, E.V.; Santoyo, G. Characterization of the antifungal and plant growth-promoting effects of diffusible and volatile organic compounds produced by Pseudomonas fluorescens strains. Biol. Control. 2015, 81, 83–92.
11. Vinale, F.; Sivasithamparam, K.; Ghisalberti, E.L.; Marra, R.; Woo, S.L.; Lorito, M. Trichoderma–plant–pathogen interactions. Soil Biol. Biochem. 2008, 40, 1–10.
12. Кадырова Г.Х., Шакиров З.С., Сафаров И.В., Хамдамова Н.А., Абдуллаев А.К. Выделение диазотрофных микроорганизмов и их влияние на рост и развитие сельскохозяйственных растений// Вестник аграрной науки Узбекистана. –2017. –№ 3 (69). – С.11-17.
13. Kadirova G.Kh., Z.S.Shakirov Identification of nitrogen-fixing and salt-resistant cyanobacteria Nostoc calcicola isolated from the rhizosphere of cotton in Uzbekistan // Environmental Science An Indian Journal. – 2012. Vol. 7. № 8. – Р.305-309.
14. Khalilov I., Kadirova G., Khalilova F. Multifuctional properties of Bacillus thuringiensis bacteria strains and a new approach in struggle with a cotton bollworm // International journal of Advanced Science and Technology. –2020. Vol. 29. №5. – Р.1652-1658.
15. Халилов И.М., Кадырова Г.Х., Шакиров З.С. Изучение ростостимулирующих свойств местных штаммов Bacillus thuringiensis на различных питательных средах //ДАН РУз. –2019. –№4. – С.64-67.
16. Stanier R.Y, Kunisawa R., Mandel M., Cohen-Bazire G. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales) // Bacteriol Rev. 1971, V.35. –N.2. –P.171-205.
17. Урюмцева Т.И., Кабдрасилова А.М. Разработка рецептуры питательной среды для культивирования бактерий Azotobacter // Вестник Алтайского государственного аграрного университета. –2019. –No 3 (173). – С.61-65.
18. Shakirov  Z.S.,  Azospirilli  of  Uzbekistan  soils  and  their influence on growth and development of wheat plants, Plant and Soil, (2006), 283, 137-145.
19. Cingel A, Savić J, Lazarević J, Ćosić T, Raspor M, Smigocki A, Ninković S. Extraordinary Adaptive Plasticity of Colorado Potato Beetle:"Ten-Striped Spearman" in the Era of Biotechnological Warfare. Int J Mol Sci. 2016 Sep 13;17(9):1538. doi: 10.3390/ijms17091538. PMID: 27649141; PMCID: PMC5037813.
20. Usmonkulova A (2023) Bioremediation of soils contaminated with nickel cations using bacteria. Soil Science and Agrochemistry pp.53–62.
21. Ahmad F., Ahmad I., Khan M.S. Indole Acetic Acid Production by the Indigenous Izolates of Azotobacter and Fluorescent Pseudomonas in the Presence and Absense of Tryptophan// Turk.J.Biol. -2005. –V.29. -P.29-34.
22. Berríos J, Illanes A, Aroca G (2004) Spectrophotometric method for determining gibberellic acid in fermentation broths. Biotechnology Letters 26: 67–70.
23. Dhawi F. The Role of Plant Growth-Promoting Microorganisms (PGPMs) and Their Feasibility in Hydroponics and Vertical Farming. Metabolites. 2023 Feb 9;13(2):247. doi: 10.3390/metabo13020247.
24. Prasanna Radha, Joshi Monica, Rana Anuj and Nain Lata Modulation of IAA Production in Cyanobacteria by Tryptophan and Light// Polish Journal of Microbiology. -2010b. -V.59. –N.2. -P. 99-105.
25. Kejela, T. (2024). Phytohormone-Producing Rhizobacteria and Their Role in Plant Growth. IntechOpen. doi: 10.5772/intechopen.1002823