ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОДУКЦИИ РЕСВЕРАТРОЛА ЭНДОФИТНЫМ ГРИБОМ Aspergillus chevalieri GF-14 В УСЛОВИЯХ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

АННОТАЦИЯ

В статье представлены данные исследований по оптимизации продукции транс-ресвератрола в условиях глубинного культивирования эндофитным грибным изолятом GF-14, выделенным из кожуры плодов винограда сорта Изабелла. В результате морфологических и молекулярно-филогенетических исследований изолят GF-14 был идентифицирован как Aspergillus chevalieri и внесен в международную базу данных NCBI как Aspergillus chevalieri GF14SMUz (OP975658.1). Установлено, что максимальный выход ресвератрола происходит на оптимизированной среде Чапека на 11-й день и составляет 1450 мкг/л, что в 4,8 раза превышает его первоначальный выход – 300 мкг/л. Подобраны оптимальные условия культивирования A. chevalieri GF14SMUz – pH 7,0, температура 28°C, размер инокулята – 10% (10⁶ спор/мл). Полученные данные показывают, что штамм гриба A. chevalieri GF14SMUz обладает большим потенциалом для улучшения продукции т-ресвератрола при глубинном культивировании и может быть многообещающим источником для получения терапевтических препаратов.

ABSTRACT

The article presents research data on optimizing the production of trans-resveratrol under conditions of submerged cultivation with endophytic fungal isolate GF-14 isolated from the peel of Isabella grape fruits. As a result of morphological and molecular phylogenetic studies, the GF-14 isolate was identified as Aspergillus chevalieri and entered into the NCBI international database as Aspergillus chevalieri GF14SMUz (OP975658.1). It was established that the maximum yield of resveratrol occurs on the optimized Czapek medium on the 11th day and is 1450 µg/l, which is 4.8 times higher than its initial yield - 300 µg/l. The optimal cultivation conditions for A.chevalieri GF14SMUz were selected – pH 7.0, temperature 28°C, inoculum size – 10% (10⁶ spores/ml). The data obtained show that the A. chevalieri GF14SMUz fungus strain has a great potential for improving the production of t-resveratrol during deep cultivation and can be a promising source for obtaining therapeutic drugs.

Ключевые слова: т-ресвератрол, эндофиты, Aspergillus chevalieri GF14SMUz, идентификация, питательные среды, оптимизация культивирования.

Keywords: t-resveratrol, endophytes, Aspergillus chevalieri GF14SMUz, identification, nutrient media, cultivation optimization.

Метаболиты производных растений, такие как транс-ресвератрол (3,5,4’-тригидроксистильбен) широко используется в качестве лекарственных ингредиентов и пищевых добавок. Ресвератрол привлекает большой исследовательский интерес благодаря своей способности предотвращать и замедлять возникновения многих заболеваний – коронарные болезни сердца, рак, образование тромбоцитов, болезнь Альцгеймера [1-3]. Ресвератрол и его производные были выделены ранее из морозника белого, из экстракта корня японского горца, из растений семейства Vitaceae. Виноград культурный – Vitis vinifera – лучший и самый важный пищевой источник стильбенов, наиболее известным среди которых является транс-ресвератрол [4].

Эндофиты – непатогенные микроорганизмы, которые обитают внутри растения и способны существовать с ними, не нанося вреда и принося определенную пользу [5]. Наиболее известные эндофиты – это грибы, производящие биоактивные вторичные метаболиты [6,7,8].

Биосинтез т-ресвератрола с использованием эндофитных микроорганизмов – это новый подход в микробной биотехнологии, поскольку он может использоваться для производства круглый год в течение более короткого периода и сроках изготовления. Многие исследователи сообщают о выделении и скрининге эндофитных грибов из V. vinifera, продуцирующих ресвератрол [9-13].

Нехватка растительного материала, из которого извлекается т-ресвератрол и время, необходимое для выращивания растений, делают этот новый микробный синтез более перспективным и выгодным. При этом, оптимизация питательных сред и условий ферментации имеет решающее значение для производства микробных метаболитов, в том числе т-ресвератрола [14,15].

В связи с этим, целью данных исследований стал подбор питательных сред и условий глубинного культивирования для увеличения продукции –ресвератрола эндофитным грибом A. chevalieri GF14SMUz.

Объект и методы исследований

Штамм A. chevalieri GF14 выращивали на агаровых косячках со средой Чапека-Докса при 28^оC до полной споруляции. Для получения инокулюма суспензию спор получали смывом с чашек стерильной дистиллированной водой с 0,85% NaCl и 2% Tween – 20. Споры доводили до нужной концентрации с использованием камеры Горяева. Микроскопические признаки изучали с помощью бинокулярного микроскопа NLCD-307B (Китай), при увеличении 10 х 40/0,65.

Засев производили в 250 мл колбы Эрленмейера, содержащие по 100 мл жидкой питательной среды. Культивирование гриба проводили на качалке при 160 об/мин. Продукцию ресвератрола в ферментационном бульоне гриба отслеживали в течение 5-17-ти суток.

Исследование влияния компонентного состава питательных сред на биосинтез т-ресвератрола проводили на трех средах следующего состава (г/л): Чапека-Докса (NaNO3 – 2, MgSO4 – 0,5, KCL – 0,5, FeSO4 – 0,01, KH2PO4 – 1,0, сахароза – 20, рН – 6-6,5); модифицированная среда Чапека для грибов (K2HPO4 – 1,00, MgSO4 – 0,50, KCl – 0,50, FeSO4 – 0,01, глюкоза – 12,5, пептон – 6,25, вода – 1 л, рН 7,3 ± 0,2); картофельно-декстрозный бульон (картофель очищенный и нарезанный кубиками – 300, декстроза – 20, вода – 1 л).

Рост штамма и синтез т-ресвератрола рассматривали в диапазоне температур 21°C, 28°C и35°C. Изучали различные значения pH среды – 5, 7, и 9. Питательные среды инокулировали по отдельности 5%, 10%, и 15%-ным инокулятом плотностью (10⁶ спор/мл).

После окончания культивирования биомассу отделяли от культуральной жидкости фильтрованием и взвешивали. Для получения экстрактов влажную биомассу и культуральную жидкость экстрагировали 3 раза этилацетатом в соотношении 3:1. Водную часть отделяли с помощью делительной воронки, этилацетатные экстракты объединяли и сушили в вакуумном испарителе Heideolph HB Digitel (Германия) при температуре 45°С в течение 2 часов. Высушенный образец растворяли в этиловом спирте (2 мл) и фильтровали с использованием шприцевого фильтра. Содержание ресвератрола рассчитывали с помощью ВЭЖХ.

Система ВЭЖХ была оборудована насосами LC-15C, оснащена C18-колонкой. Состав элюента: ацетонитрил и 0.1% фосфорная кислота (30:70 v/v). Объем вводимого образца – 20 μl. Скорость протока 1.0 мл/мин при длине волны 306 nm. В качестве контроля использовали стандартный транс-ресвератрол. Продуктивность грибного ресвератрола определяли по кривой стандартного т-ресвератрола (0,1–1 мг/мл) (Sigma-Aldrich) в аналогичных условиях. 

Результаты и их обсуждение

Штаммы, предназначенные для коммерческого использования, должны быть четко идентифицированы. Характеристика и идентификация штамма до видового уровня – это первый шаг к использованию всего потенциала грибка для конкретных целей. 

Для описания изолята GF-14 на седьмые и 14-е сутки учитывался характер роста колоний, строение мицелия, окраска, размер и форма конидий и аскоспор.

Морфологическая характеристика показала, что изолят GF-14 образует округлые колонии, от желтого до темно-желтого цвета с ровными краями. Округлая колония быстро распространяется на агаризованной среде Чапека с добавлением 20 % сахарозы и достигает 15-17 мм в диаметре через 7 дней, и 23-31 мм в диаметре через 14 дней при 28 ºC. Культура в течение 4-5 дней образуют споры желтого цвета (рис. 1).
  
 

Рисунок 1. Морфология A. chevalieri GF14SMUz

Конидии яйцевидные, длиной 4,5-5,5 мкм, имеют характерную шероховатую поверхность. Аскоспоры желтые, эллипсовидные, 5 х 3,5 мкм с гладкими выпуклыми стенками и тонкими выступающими хорошо разделенными экваториальными гребнями.

Эти морфологические характеристики указывают на род Aspergillus. Из-за сходства морфологических признаков видов Аspergillus и распространения морфологически скрытых видов трудно четко идентифицировать виды на основе их морфологии. 

Молекулярно-биологические методы, основанные на полимерной цепной реакции (ПЦР), в последние годы используются для идентификации и дифференциации микроорганизмов.

Рисунок 2. Молекулярная таксономия и филогенетический анализ на основе ITS изолята GF14

Нуклеотидные последовательности определяли путем секвенирования ITS-областей этого изолята, а полученные данные анализировали программой BLAST в международной базе данных NCBI, согласно которой изолят GF14 был на 97% сходен с Aspergillus chevalieri (КТ826616.1). Для сравнения с данными этой базы данных было построено филогенетическое дерево изолята методом «neighborjoining» в программе MEGПо ITS-части и морфологической идентификации этого штамма он был назван штаммом Aspergillus chevalieri GF14SMUz (Рис. 2).

Хорошо известно, что продукция вторичных метаболитов зависит от физиологических параметров и параметров питания. Оптимизация питательных сред и условий ферментации имеет решающее значение для максимального производства грибных метаболитов, что часто требуется для повышения скорости реакции.

Картофельно-декстрозная среда часто применяется для изучения ресвератрол-продуцирующей способности в грибных эндофитах [14, 16, 17]. Например, при изоляции и идентификации эндофитов-продуцентов ресвератрола из винограда Cabernet Sauvignon, отобран наиболее активный штамм Aspergillus niger, продуцирующий на картофельно-декстрозном бульоне 1,48 мг/л ресвератрола [12].

При исследовании продукции ресвератрола A. chevalieri GF14SMUz на картофельной среде показано, что синтез ресвератрола возрастает после уменьшения накопления биомассы, в фазу отмирания клеток. Максимальный рост биомассы культуры – 38,2 г/л наблюдается на 9-е сутки, а наиболее высокий выход ресвератрола зарегистрирован на 13-е сутки культивирования – 214,0 мкг/л при выходе биомассы 24,1±0,9 г/л (Рис. 3).

Рисунок 3. Динамика продукции ресвератрола и накопления биомассы штаммом A. chevalieri GF14SMUz на картофельно-декстрозной среде

При исследовании продукции ресвератрола на среде Чапека показано, что синтез т-ресвератрола проявляет рост-связанную кинетику и представляет собой как продукт, произведенный повышенным метаболизмом гриба. Так, синтез т-ресвератрола A. chevalieri GF14SMUz значительно увеличивается на 11-е сутки до 300 мкг/л, а затем постепенно понижается до концентрации 210 мкг/л на 17-е сутки роста. При этом, продукция ресвератрола достигает максимального значения в начале стационарной фазы роста гриба (Рис. 4).

Аналогичные данные были получены Shi, J., etal. при исследовании продукции т-ресвератрола у Alternaria sp.MG1. Авторами показано, что увеличение выхода ресвератрола прямо пропорционально увеличению биомассы, что позволяет предположить, что ресвератрол может быть конститутивным продуктом [14].

Рисунок 4. Динамика продукции ресвератрола и накопления биомассы A. chevalieri GF14SMUz на среде Чапека-Докса

Vagish Dwibedi et al. установлено, что источники азота и углерода оказывают статически значимое влияние на грибковую биомассу, а также производство ресвератрола. Было замечено, что пептон поддерживал максимальное производство ресвератрола в эндофитном грибе Arcopilus aureus (105,3 ± 0,92 мкг/мл). При этом наименьшее производство ресвератрола наблюдалось на среде с сульфатом аммония (93,21 ± 1,39 мкг/мл) и экстрактом говядины (96,66 ± 1,63 мкг/мл) [15].

Действительно, нами при культивировании A. chevalieri GF14SMUz на модифицированной среде Чапека c пептоном, была зарегистрирована максимальная продукция т-ресвератрола на 11-й день – 1450 мкг/л, тогда как наиболее высокий рост биомассы – 15,5 мг/л наблюдался на 9-й день (Рис. 5).

Рисунок 5. Динамика продукции ресвератрола и накопления биомассы A. chevalieri GF14SMUz на модифицированной среде Чапека

Таким образом, для дальнейших исследований была выбрана модифицированная среда Чапека, показавшая максимальное производство ресвератрола.

Известно, что размер и плотность инокулята играет важную роль в росте и продукции вторичных метаболитов. Уменьшение количества инокулята приводит к относительно медленному увеличению развития грибковых клеток, в то время как чрезмерное количество инокулята может вызывать дегенерацию клеток, что приводит к снижению биомассы.

В нашем исследовании было установлено, что оптимальная плотность инокулята – при концентрации 10% (10⁶ спор/мл) была предпочтительна для получения максимального роста и выхода ресвератрола при культивировании A. chevalieri GF14SMUz. Сравнительное исследование влияния двух других концентраций инокулята 5% и 15% показало менее положительный эффект (Рис. 6).

Рисунок 6. Влияние размера инокулята на продукцию ресвератрола A. chevalieri GF14SMUz

Кроме того, предполагалось, что производство ресвератрола было связано с адаптацией культуры к температуре инкубации.

Оптимальная температура с самым высоким уровнем т-ресвератрола – 1440 мкг/л была зафиксирована нами при 28°C. В то время как при низкой температуре 15°C, и при более высокой температуре 36°С, наблюдается меньшая продукция т-ресвератрола (Рис. 7). Roat et al. также зафиксировали на уровне 28 °C самый высокий выход т-ресвератрола (299 мкг/л) штаммом Aspergillus stellifer AB4 [13].

Рисунок 7. Влияние температуры культивирования A. chevalieri GF14SMUz на продукцию ресвератрола

Значительную роль в метаболизме и/или биосинтезе вторичных метаболитов играет pH среды, так как это связано с клеточной стенкой и свойствами проницаемости клеточной мембраны для захвата ионов или их потери в питательной среде.

Нами показано, что весьма кислый рН 5 и сильно щелочной рН 9 не так значительно поддерживали рост и производство т-ресвератрола. Нейтральный рН-7 был самым оптимальным для роста A. chevalieri GF14SMUz и производства т-ресвератрола- 1450 мкг/л в (рис.8). Shi J et al. также сообщали, что самое высокое производство т-ресвератрола грибом Alternaria sp. MG1 было при pH – 7 [14].

Рисунок 8. Продукцию ресвератролаA.chevalieriGF14SMUz при различных значениях рН среды

Полученные данные показали, что эндофитный гриб A. chevalieri GF14SMUz обладает большим потенциалом для улучшения продукции т-ресвератрола при глубинном культивировании в колбах за короткий период времени. Однако для коммерческой разработки технологии производства т-ресвератрола требуются комбинации биотехнологических подходов, улучшение штамма ферментацией и генетическими манипуляциями.

Таким образом, повышение производства ресвератрола в Aspergillus chevalieri GF14SMUz за счет оптимизации процесса ферментации еще больше открывает возможности последующего улучшения культуры для коммерческой разработки производства препаратов ресвератрола грибного происхождения.

Список литературы:

1. Philipp Saiko, AkosSzakmary, Walter Jaeger, Walter Jaeger, Thomas Szekeres. Resveratrol and its analogs: Defense against cancer, coronary disease and neurodegenerative maladies or just a fad?  Mutation Research/Reviews in Mutation Research Volume 658, Issues 1–2, January–February 2008, Pages 68-94.
2. Baur, J. A., and Sinclair, D. A. (2006). Therapeutic potential of resveratrol: the in vivo evidence. Nat. Rev. Drug. Discov. 5, 493–506. doi: 10.1038/nrd2060
3. Zordoky BN, Robertson IM, Dyck JR. Preclinical and clinical evidence for the role of resveratrol in the treatment of cardiovascular diseases. BiochimBiophysActa. 2014; 852:1155–1177. [PubMed: 25451966]
4. Goldberg, D. M.; 1996: Regional differences in resveratrol isomer con-centrations of wines from various cultivars. J. Wine Res. 7, 13-24.
5. AntenehAdemeMengistu. Endophytes: Colonization, Behaviour, and Their Role in Defense Mechanism International Journal of Microbiology Volume 2020, Article ID 6927219, 8 pages
6. Aly, A.H., Debbab, A. &Proksch, P. (2011) Fungal endophytes: unique plant inhabitants with great promises. Applied Microbiology and Biotechnology, 90, 1829– 1845.
7. Mohamed, H., Hassane, A., Atta, O., and Song, Y. (2021a). Deep learning strategies for active secondary metabolites biosynthesis from fungi: harnessing artificial manipulation and application. Biocatal. Agric. Biotechnol. 38:102195. doi: 10.1016/j.bcab.2021.102195
8. Hassane, A. M. A., Hussien, S. M., Abouelela, M. E., Taha, T. M., Awad, M. F., Mohamed, H., et al. (2022b). In vitro and in silico antioxidant efficiency of bio-potent secondary metabolites from different taxa of black seed-producing plants and their derived mycoendophytes. Front. Bioeng. Biotechnol. 10:930161. doi: 10.3389/fbioe.2022.930161
9. Dwibedi, V., and Saxena, S. (2018). Arcopilus aureus, a resveratrol-producing endophyte from Vitisvinifera. Appl. Biochem. Biotechnol. 186, 476–495. doi: 10.1007/s12010-018-2755-x
10. Dwibedi, V., and Saxena, S. (2019a). Diversity and phylogeny of resveratrol-producing culturable endophytic fungi from Vitis species in India. 3 Biotech 9:182. doi: 10.1007/s13205-019-1712-x
11. Liu, Y., Nan, L., Liu, J., Yan, H., Zhang, D., and Han, X. (2016a). Isolation and identification of resveratrol-producing endophytes from wine grape Cabernet Sauvignon. Springerplus 5:1029. doi: 10.1186/s40064-016-2571-0
12. Ya Liu, corresponding author LijunNan,corresponding author Junchao Liu, Haiyan Yan, Dianpeng Zhang, and Xinnian Han Isolation and identification of resveratrol-producing endophytes from wine grape Cabernet Sauvignon 2016; 5(1):
13. Roat, C., and Saraf, M. (2020). Isolation and characterization of t-resveratrol and α-viniferin, a bioactive secondary metabolite of an endophytic fungus Aspergillus stellifer AB4, from Vitisvinifera. J. Microbiol. Biotechnol. Food Sci. 9, 708–713. doi: 10.15414/jmbfs.2020.9.4.708-71313.
14. Shi, J., Zeng, Q., Liu, Y., and Pan, Z. (2012). Alternaria sp. MG1, a resveratrol-producing fungus: isolation, identification, and optimal cultivation conditions for resveratrol production. Appl. Microbiol. Biotechnol. 95, 369–379. doi: 10.1007/s00253-012-4045-9
15. Dwibedi, V., Rath, S. K., Prakash, R., and Saxena, S. (2021). Response surface statistical optimization of fermentation parameters for resveratrol production by the endophytic fungus Arcopilus aureus and its tyrosinase inhibitory activity. Biotechnol. Lett. 43, 627–644. doi: 10.1007/s10529-020-03032-7
16. Dwibedi, V., Kalia, S., and Saxena, S. (2019). Isolation and enhancement of resveratrol production in Xylariapsidii by exploring the phenomenon of epigenetics: using DNA methyltransferases and histone deacetylase as epigenetic modifiers. Mol. Biol. Rep. 46, 4123–4137. doi: 10.1007/s11033-019-04862-z
17. Abdel-Hadi, A., Aloyuni, S., Alharbi, R., Jahan, S., Darwish, O., Senthilkumar, S., et al. (2022). Stroke preventing effect of resveratrol isolated from fungi and in vivo activity in male albino rats. J. KingSaudUniv. Sci. 34:102074. doi: 10.1016/j.jksus.2022.102074