ФОСФАТ-СОЛЮБИЛИЗИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ РИЗОБАКТЕРИЙ ПШЕНИЦЫ (Triticum aestivum L.)

АННОТАЦИЯ

В данной работе из ризосферы пшеницы выделены и идентифицированы местные штаммы  фосфат-солюбилизирующих микроорганизмы: Acinebacter pittii 1К, Acinebacter pittii 2К, Clostridium chauvoei 4К, Enterobacter cloacae 9К, Pseudomonas monteilii 10К, Bacillus cereus 11К, Exiguobacterium sp.12К, Bacillus cereus 16К, Serratia marcescens 21К, Bacillus megaterium Hd, Pseudomonas aeruginosa 23A, Pseudomonas aeruginosa 28A, Bacillus megaterium 32A, Bacillus pumilus 33A, Enterobacter cloacae 34A, Bacillus subtilis 35A, Enterobacter cloacae FA, Bacillus megaterium РЕ,  Lactobacillus sakei 28. Исследуемые штаммы на среде Пиковской с индикатором показали от 50% до  100%  фосфат-солюбилизирующую активность. Следует отметить, что у наиболее активных фосфатсолюбилизирующих штаммов Acinebacter pittii 1К, Acinebacter pittii 2К, Enterobacter cloacae 9К,  Bacillus cereus 11К, Serratia marcescens 21К, Enterobacter cloacae FA, Pseudomonas aeruginosa 23A, Enterobacter cloacae 34A, Bacillus subtilis 35A общее количество титруемых кислот в течение 15 суток остается на уровне от 16,4 мг/мл до 36,0 мг/мл.

ABSTRACT

In this work, local strains of phosphate-solubilizing microorganisms were isolated and identified from the wheat rhizosphere: Acinebacter pittii 1К, Acinebacter pittii 2К, Clostridium chauvoei 4К, Enterobacter cloacae 9К, Pseudomonas monteilii 10К, Bacillus cereus 11К, Exiguobacterium sp.12К, Bacillus cereus 16К, Serratia marcescens 21К, Bacillus megaterium Hd, Pseudomonas aeruginosa 23A, Pseudomonas aeruginosa 28A, Bacillus megaterium 32A, Bacillus pumilus 33A, Enterobacter cloacae 34A, Bacillus subtilis 35A, Enterobacter cloacae FA, Bacillus megaterium РЕ,  Lactobacillus sakei 28. The studied strains on Pikovskaya's medium with an indicator showed from 50% to 100% phosphate-solubilizing activity. It should be noted that in the most active phosphate-solubilizing strains Acinebacter pittii 1К, Acinebacter pittii 2К, Enterobacter cloacae 9К, Bacillus cereus 11К, Serratia marcescens 21К, Enterobacter cloacae FA, Pseudomonas aeruginosa 23A, Enterobacter cloacae 34A, Bacillus subtilis 35A the total amount of titratable acids for 15 days remains at the level of 16.4 mg/ml to 36.0 mg/ml.

Ключевые слова: бактерии, ризосфера, фосфат-солюбилизирующая активность, скрининг, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens, Bacillus cereus, пшеница, кислотообразование

Keywords: bacteria, rhizosphere, phosphate-solubilizing activity, screening, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens, Bacillus cereus, wheat, acid formation

Введение

Современные методы ведения сельского хозяйства заметно зависят от химических удобрений [1, 2]. Однако большая часть применяемых фосфорных - удобрений, быстро иммобилизуется почвенными частицами и становятся недоступными для широкого круга растений. Синтез производимых химических фосфорных - удобрений требует значительных количеств высококачественных фосфоритных пород, который приводит к значительному сокращению глобальных запасов фосфора [3]. К сожалению, избыток химических фосфорных удобрений компенсирует нехватки почвенного фосфора, что отрицательно сказывается на здоровье человека и создает множество серьезных экологических последствий [4-6]. Соответственно, следует уменьшить применение фосфорных удобрений [7] в пользу поиска альтернативных устойчивых фосфорных ресурсов, которые могут помочь поддерживать производство растений и решать экологические проблемы [8]. Альтернативой для существующих химических методов извлечения фосфора может служить процесс прямого микробиологического высвобождения (солюбилизации) фосфатов из нерастворимого сырья. Процесс основан на использовании метаболической активности фосфат-солюбилизирующих микроорганизмов (ФСМ). Однако, широкое применение ФСМ в сельском хозяйстве и, в особенности, в промышленности затруднено в силу ряда причин: недостаточно изучена биохимия процессов микробной ФС, нет полного представления о биоразнообразии ФСМ и экологических нишах их обитания. Известно, что в минерализации фосфатов участвуют бактерии родов Pseudomonas, Bacillus, Burkholderia, Beijerinckia, Enterobacter, Pantoea, Paraburkholderia, Cronobacter, Ralstonia, Curtobacterium, Rhodococcus, Arthrobacter, Serratia, Xanthomonas, Klebsiella, Agrobacterium, Azotobacter; семейства Actinomycetaceae и грибы рода Penicillium и др. [9-13].

Особенно большое количество органических фосфатов накапливается при внесении в почву фосфорных удобрений или при достаточном обеспечении почвы усвояемым фосфором. Тогда происходит так называемая биологическая иммобилизация фосфора: усвояемый фосфор используется микроорганизмами и включается в органические соединения микробной клетки. Прямая микробная мобилизация фосфатов может служить основой для использования в агротехнологиях в виде биофосфорных удобрений.

Целью данной работы является выделение фосфат-солюбилизирующих микроорганизмов из ризосферы пшеницы (Triticum aestivum L.) и проведение скрининга на кислотообразующую способность.

Материалы и методы исследования

Сбор образцов

Образцы пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта сорта «Аср», «Яксарт» и «Гром» в фазе цветения-колошения вместе с насыпной ризосферной почвой были собраны с полей Ташкентской и Сырьдаринской области Республики Узбекистан.  Образцы были помещены индивидуально в пластиковые пакеты и доставлены в институт Микробиологии академии Наук Республики Узбекистан для выделения ФСМ.

Выделение фосфат-солюбилизирующих микроорганизмов

Ризосферные бактерии были выделены из 1 г почвы, плотно прилегающей к корням растений, путем посева в колбы со 10 мл стерильной жидкой питательной среды с МПА или ПА (питательный агар) и при комнатной температуре встряхивали на шейкере в течение 30 мин и 160 об/мин, после чего из полученной суспензии готовили десятикратные разведения: от 10^-1 до  10^-6. По 0,1 мл из разведений 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6 переносили в чашки Петри на поверхность мясопептонного или питательного агара, инкубировали в инкубаторе-термостате (Binder, Германия) при 30±1°C до появления бактериальных колоний (1-3 суток). Однотипные колонии принимали за колонии одного микробного вида и отсевали в чистую культуру для дальнейшего исследования. Морфологические свойства микроорганизмов изучали с помощью светового микроскопа LEICA DM 1000 (Германия) методом классической окраски бактерий по Грамму [14].

Методы идентификации фосфат-солюбилизирующих микроорганизмов

Для идентификации ФСМ был использован метод времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS). Идентификацию микроорганизмов проводили на основе сопоставления данных о составе и соотношении пептидов, полученных гидролизом белков в колонии исследуемого микроорганизма, с аналогичными данными типовых штаммов из базы данных MALDI Biotyper v. 2.0.4. (Bruker Daltonik GmbH, Германия).

Фосфат-солюбилизирующая активность микроорганизмов

Качественный тест на кислотообразование выделенных ФСМ проверяли на среде Пиковской с Са₃(РО₄)₂ с индикатором. Исходный цвет питательной среды был темно фиолетового цвета. В случае изменения реакции среды в кислую сторону под действием метаболитов ФСМ происходило обесцвечивание питательной среды.

Определение общего количества титруемых кислот проводили по методу Ермакова А.И. [15]. Статистическую обработку экспериментальных данных осуществляли стандартными методами расчета ошибок, средних, доверительных интервалов, стандартных отклонений. Все расчеты и математические анализы выполнены с помощью программы Microsoft Excel 2007 [16].

Результаты и их обсуждение

Ранее нами было изучено фосфат-солюбилизирующая и ростостимулирующая активность Pseudomonas aeruginosa С10 изолированной из ризосферы пшеницы сорта «Дустлик» возделываемый в Кашкадарьинской области [17].

В данной работе из корневой зоны пшеницы (Triticum aestivum L.), культивируемых в регионах Ташкентского и Кашкадарьинского областей Республики, сорта «Аср», «Яксарт» и «Гром» было выделено 48 изолятов (чистые культуры) ФСМ. Среди выделенных в чистую культуру 48 изолятов 20 продемонстрировали свою способность растворять трикальцийфосфат на питательной среде Пиковский с индикатором, образуя прозрачную зону в динамике роста и развития.  Они были обозначены нами как местные фосфат-солюбилизирующие изоляты. Изолированные культуры проявляли различные морфологические характеристики, например, размеры колоний варьировались от средних до крупных, а их текстура была либо блестящей, тусклой, либо слизистой. Форма колоний была округлой или точечной, высота их варьировала от выпуклой до плоской. Цвет изолятов варьировал от желто-оранжевого до белого.

Следовательно, ризосферные изоляты выделенные в чистую культуру были проанализированы на фосфат-солюбилизирующую способность в течение 3 суток на среде с трикальцийфосфатом. Следует отметить, что  через 3 часа культивирования на среде Пиковской следующие изоляты  ризосферных бактерий пшеницы: 2К; 11К, 35А; 9К и 12К показали от 50% до  100% фосфат-солюбилизирующую активность.  Через 24 часа культивирования ризосферных изолятов на среде Пиковской выявлено, что активными ФСМ являются, изоляты: 2К, 4К, 9К, 10К, 21К, 32А, 34А, 35А, 1К, 11К, 12К, 16К, 27А, 28А (рис.1). Далее на рисунке 2 приведены данные по ФС активности изолятов: 1К, 2К, 4К, 9К, 10К, 11К, 12К, 16К, 21К, 32А, 34А, 35А; 28А, 12К, 28А; 23А, 36А, 40А через 48 час культивирования.  Таким образом, среди исследованных ризосферных культур по ФС активности отобрано следующие культуры: 2d, FA, 1К, 2К, 4К, 9К, 10К, 11К, 12К, 16К, 21К, 23А, 28А, 32А, 33А, 34А, 35А.

Далее, для идентификации наиболее активных ФСМ был использован метод времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS). Как видно из таблицы 1 наиболее активные штаммы ФСМ относятся к роду: Acinebacter, Clostridium, Enterobacter, Pseudomonas, Bacillus, Exiguobacterium и Serratia. Использование альтернативных источников фосфора требует химической обработки, поскольку фосфор, присутствующий в этих материалах, недоступен для растений и не может быть непосредственно внесен в почву. Возможной альтернативой обработки фосфорсодержащих стоков кислотами, полученными в химической промышленности [18], является использование органических кислот, продуцирующих микроорганизмами, присутствующих в почве. Одна из наиболее доминирующих ризосферных бактерий рода Bacillus (B. subtilis, B. cereus, B. thuringiensis, B. pumilus, B. megaterium и др.) разработала различные механизмы для усиления роста растений за счет увеличения доступности питательных веществ [19, 20].

Одним из основных механизмов, признанных ответственными за высвобождение доступных форм фосфора растениями в почве, является производство органических кислот (солюбилизация нерастворимых неорганических фосфатных соединений, таких как трикальцийфосфат, дикальцийфосфат, гидроксиапатит и каменный фосфат) [9] и повышение активности кислых фосфатаз (минерализация органического фосфора). ФСМ очень важны для растений в условиях дефицита фосфора [21]. В некоторых случаях солюбилизация фосфатов индуцируется фосфатным голоданием. Концентрация органических кислот уменьшается с увеличением подачи фосфора.

Следовательно, следующим этапом исследований является определение образование общих титруюмых кислот активными ФСМ.

Рисунок 1. Фосфат-солюбилизирующая активность ризосферных изолятов: 2К, 4К, 9К, 10К, 21К, 32А, 34А, 35А, 1К, 11К, 12К, 16К, 27А, 28А через 24 часа культивирования на среде Пиковской к контролю

Рисунок 2. Фосфат-солюбилизирующая активность ризосферных изолятов: 1К, 2К, 4К, 9К, 10К, 11К, 12К, 16К, 21К, 32А, 34А, 35А; 28А, 12К, 28А, 23А, 36А, 40А через 48 часа культивирования на среде Пиковской к контролю

 Таблица 1.

Идентификация фосфат-солюбилизирующих бактерий

В таблице 2 приведены данные о кислотообразующей способности изучаемых ризосферных бактерий пшеницы в динамике роста и развития в течение 15 суток. Так, все исследованные бактерии образуют органические кислоты, но самыми активными кислотообразующими культурами являются Acinebacter pittii 1К, Bacillus cereus 11К, Acinebacter pittii 2К, Enterobacter cloacae 9К, Exiguobacterium sp.12К, Bacillus cereus 16К, Serratia marcescens 21К, Enterobacter cloacae FA, Pseudomonas aeruginosa 23A, Pseudomonas aeruginosa 28A, Enterobacter cloacae 34A и Bacillus subtilis 35A. Следует отметить, что у наиболее активного ФС штамма Serratia marcescens 21К общее количество титруемых кислот в течение 15 суток остается на уровне от 28,4 мг/мл до 36,0 мг/мл.

Таблица 2.

Общее количество титруемых кислот почвенными и ризобактериями пщеницы

Известно, что глюконовая, муравьиная, 2-кетоглюконовая, лимонная, щавелевая, молочная, изовалериановая, янтарная, гликолевая и уксусная кислоты входят в число некоторых кислот, продуцируемых ФСМ [22]. В дополнение были также идентифицированы пировиноградная, яблочная, фумаровая и альфа-кетоглутаровая кислоты [23]. Источник углерода имеет решающее значение для природы и типа кислоты, продуцируемой ФСМ [21]. Производство органических кислот приводит к снижению рН в окружающей среде. Более низкий рН среды свидетельствует о высвобождении органических кислот Р-солюбилизирующими микроорганизмами по пути прямого окисления, происходящему на внешней стороне цитоплазматической мембраны [22].

Таким образом, способностью превращать фосфорсодержащие соединения как минеральные, так и органические с высвобождением фосфора в окружающую среду, обладает большинство микроорганизмов. Так, из почвенных и ризосферных образцов пшеницы изолирована в чистые культуры активные ФСМ: Acinebacter pittii 1К, Acinebacter pittii 2К, Clostridium chauvoei 4К, Enterobacter cloacae 9К, Pseudomonas monteilii 10К, Bacillus cereus 11К, Exiguobacterium sp.12К, Bacillus cereus 16К, Serratia marcescens 21К, Bacillus megaterium Hd, Pseudomonas aeruginosa 23A, Pseudomonas aeruginosa 28A, Bacillus megaterium 32A, Bacillus pumilus 33A, Enterobacter cloacae 34A, Bacillus subtilis 35A, Enterobacter cloacae FA, Bacillus megaterium РЕ,  Lactobacillus sakei 28А. На сегодняшний день, первоочередных задач устойчивого развития сельского хозяйства является повышение биодоступности фосфатов для растениеводства. В данном контексте изолированные местные штаммы ризосферных микроорганизмов, растворяющие фосфаты, обладают огромной эффективностью в качестве биоудобрений, поскольку они повышают биодоступность фосфора для растений, способствуют устойчивому сельскому хозяйству, улучшают плодородия почвы и урожайность сельскохозяйственных культур.

Список литературы:

1. Shi Wang, Robert Walker, Marcus Schicklberger, Peter S. Nico, Patricia M. Fox, Ulas Karaoz, Romy Chakraborty and Eoin L. Brodie Microbial phosphorus mobilization strategies across a natural nutrient limitation gradient and evidence for linkage with iron solubilization traits. (2021). Front. Microbiol. 12:572212.
2. Zhang, Z., Liao, H., Lucas, W. J. (2014): Molecular mechanisms underlying phosphate sensing, signaling, and adaptation in plants. J. Integr. Plant Biol. 56, 192–220.
3. Cordell, D.,White, S. (2014): Life’s bottleneck: sustaining the world’s phosphorus for a food secure future. Annu. Rev. Environ. Resour. 39, 161–188.
4. Lo´pez-Arredondo, D. L., Leyva-Gonza´lez, M. A., Gonza´lez-Morales, S. I., Lo´pez-Bucio, J.,Herrera-Estrella, L. (2014): Phosphate nutrition: improving low-phosphate tolerance in crops. Annu. Rev. Plant Biol. 65, 95–123.
5. Shepherd, J. G., Kleemann, R., Bahri-Esfahani, J., Hudek, L., Suriyagoda, L., Vandamme, E.,van Dijk, K. C. (2016): The future of phosphorus in our hands. Nutr. Cycl. Agroecosyst. 104, 281–287.
6. Grenon, G., Singh, B., De Sena, A., Madramootoo, C. A., von Sperber, C., Goyal, M. K. and Tiequan Zhang. (2021). Phosphorus Fate, Transport and Management on Subsurface Drained Agricultural Organic Soils: a Review. Environ. Res. Lett. 16, 013004.
7. George TS, Hinsinger P, Turner BL (2016) Phosphorus in soils and plants–facing phosphorus scarcity. Plant Soil 401:1.
8. Nash, D. M., Haygarth, P. M.,Turner, B. L.,Condron, L. M., McDowell, R. W.,Richardson, A. E.,Watkins, M.,Heaven, M. W. (2014): Using organic phosphorus to sustain pasture productivity:a perspective. Geoderma 221, 11–19.
9. Oteino N., Lally R.D., Kiwanuka S., Lloyd A., Ryan D., Germaine K.J., Dowling D.N. Plant growth promotion induced by phosphate solubilizing endophytic Pseudomonas isolates. Front. Microbiol. 2015; 6:745.
10. Wang Z, Xu G, Ma P, Lin Y, Yang X, Cao C. Isolation and Characterization of a Phosphorus-Solubilizing Bacterium from Rhizosphere Soils and Its Colonization of Chinese Cabbage (Brassica campestris ssp. chinensis). Front Microbiol. 2017 Jul 26; 8:1270.
11. Mohamed EAH, Farag AG, Youssef SA. Phosphate solubilization by Bacillus subtilis and Serratia marcescens isolated from tomato plant rhizosphere. J Environ Prot. 2018; 09:266-277.
12. Li KS, Zeghbroeck J. V, Liu Q and Zhang S (2021) Isolating and Characterizing Phosphorus Solubilizing Bacteria From Rhizospheres of Native Plants Grown in Calcareous Soils. Front. Environ. Sci. 9:802563.
13. Kirui CK, Njeru EM, Runo S. Diversity and Phosphate Solubilization Efficiency of Phosphate Solubilizing Bacteria Isolated from Semi-Arid Agroecosystems of Eastern Kenya. Microbiol Insights. 2022 Apr 17.
14. Практикум по микробиологии: Учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / А.И. Нетрусов, М.А. Егорова, Л.М. Захарчук, Т.Ю. Динариева и др.; под ред. А.И. Нетрусова. – М.: Издательский центр "Академия", 2005. –608с.
15. Ермаков А.И. Методы биохимических исследований растений. Ленинград 1972, с.192-194.
16.  Larkin M.A., Blackshields G., Brown N.P., Chenna R., McGettigan P.A., McWilliam H., Valentin F., Wallace I.M., Wilm, A., Lopez R., Thompson J.D., Gibson T.J., Higgins D.G. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 2007. vol. 23. pp. 2947-2948.
17. Kadirova G.Kh,  Zakiryaeva S.I.,  Abdullaev A.K., Usmankulova A.A., Payzilloev A.K.  Growth stimulating and phosphorus-mobilizing activity of wheat rhizobacteria (Triticum aestivum l.) of the genus pseudomonas and bacillus. Chin J Ind Hyg Occup Dis, 2021, Р.669-679.
18. Schroder J.J., Cordell D., Smit A.L., Rosemarin A. Sustainable Use of Phosphorus. Volume 357 Plant Research International; Wageningen, The Netherlands: 2010.
19. Meena V.S., Maurya B.R., Meena S.K., Meena R.K., Kumar A., Verma J.P., Singh N.P. Can Bacillus Species Enhance Nutrient Availability in Agricultural Soils? In: Islam M., Rahman M., Pandey P., Jha C., Aeron A., editors. Bacilli and Agrobiotechnology. Springer; Cham, Switzerland: 2016.
20. Cheng J., Zhuang W., Li N.N., Tang C.L., Ying H.J. Efficient biosynthesis of d-ribose using a novel co-feeding strategy in Bacillus subtilis without acid formation. Lett. Appl. Microbiol. 2017; 64:73–78.
21. Krishnaraj P.U., Dahale S. Mineral Phosphate Solubilization: Concepts and Prospects in Sustainable Agriculture. Proc. Indian Natl. Sci. Acad. 2014; 80:389–405.
22. Pande A., Pandey P., Mehra S., Singh M., Kaushik S. Phenotypic and genotypic characterization of phosphate solubilizing bacteria and their efficiency on the growth of maize. J. Genet. Eng. Biotechnol. 2017; 15:379–391.
23. Mardad I., Serrano A., Soukri A. Solubilization of inorganic phosphate and production of organic acids by bacteria isolated from a Moroccan mineral phosphate deposit. Afr. J. Microbiol. Res. 2013; 7:626–635.