МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ БАКТЕРИЙ ПРИ СТРЕССЕ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ

АННОТАЦИЯ

Изменение морфологии бактерий в различных стрессовых условиях окружающей среды считается одним из механизмов их адаптации к внешним неблагоприятным воздействиям. Морфологические изменения в клетках микроорганизмов являются ранним признаком изменения некоторых биохимических свойств. В этом исследовании были определены морфологические, культуральные и биохимические свойства бактерий, выделенных из почв, загрязненных тяжелыми металлами, при различных концентрациях ионов тяжелых металлов Cu^2+, Cd²⁺ и Ni²⁺. Результаты эксперимента показали, что максимальные изменения размера клеток наблюдались под воздействием Cu²⁺ и Cd²⁺ в концентрации 354 мг/л и 24,6 мг/л, соответственно. Изолированные нормальные клетки кокковидных и бацилярных бактерий под действием ионов Cd²⁺ образовывали между клетками связи, образуя характерные цепи; в результате индукции Cu²⁺ клетки приобретали округлую форму; в присутствии ионов Ni²⁺ клетки собираются в группы. Были исследованы физиологические признаки бактерий с высокой жизнеспособностью к высоким концентрациям тяжелых металлов по сравнению с контрольной группой.

ABSTRACT

Changes in the morphology of bacteria under various stressful environmental conditions are considered one of the mechanisms for their adaptation to external adverse effects. Morphological changes in microorganism cells are an early sign of changes in some biochemical properties. In this study, the morphological, cultural, and biochemical properties of bacteria isolated from soils contaminated with heavy metals were determined at various concentrations of heavy metal ions Cu²⁺, Cd²⁺, and Ni²⁺. The results of the experiment showed that the maximum changes in cell size were observed under the influence of Cu²⁺ and Cd²⁺ at a concentration of 354.0 mg/l and 24.6 mg/l, respectively. Isolated normal cells of coccoid and bacillary bacteria, under the action of Cd²⁺ ions, formed bonds between cells, forming characteristic chains; as a result of Cu²⁺ induction, the cells acquired a rounded shape; in the presence of Ni²⁺ ions, cells gather into groups. Physiological signs of bacteria with high viability to high concentrations of heavy metals were studied in comparison with the control group.

Ключевые слова: тяжелые металлы, бактерии, жизнеспособность, Cu(II), CD(II), Ni(II), углеводы, морфологические и биохимические изменения

Keywords: heavy metals, bacteria, viability, Cu(II), CD(II), Ni(II), carbohydrates, morphological and biochemical changes

Введение

Антропогенная деятельность, особенно добыча полезных ископаемых и плавка, производство в промышленном секторе, использование металлов и металлосодержащих соединений в домашнем и сельском хозяйстве, является основной причиной широкого распространения токсичных тяжелых металлов по всему земному шару и снижения экологической безопасности [1]. Тяжелые металлы удаляются из металлообрабатывающей промышленности, что приводит к их прямому или косвенному накоплению в водных и почвенных системах окружающей среды. Поскольку тяжелые металлы остаются в природе в течение длительного времени, они представляют серьезную опасность для всего живого и даже в очень низких концентрациях имеют серьезные последствия для здоровья человека [2]. Микроорганизмы в почве и воде принимают непосредственное участие в снижении токсического воздействия тяжелых металлов. В первую очередь, у них формируется адаптационные механизмы к стрессовой реакции. Симптомы реакции на стресс, основанные на морфологических и биохимических изменениях, важны для смягчения и оптимизации побочных эффектов [3]. Морфологические изменения представляют собой раннюю стрессовую реакцию на токсичность металлов в механизмах адаптации [4]. Уменьшение размера клеток у Lysinibacillus fusiformis из-за накопления ионов Cd(II) и Cu(II) подтверждает морфологические изменения, связанные с усилением процесса биотрансформации [5]. При детоксикации Cd(II) у Pseudomonas putida увеличивается размер клетки, что свидетельствует о накоплении ионов металлов на внешней мембране в виде пузырьков. Эти данные свидетельствуют о дифференцированном разнообразии биоремедиации и управления стрессом, что требует обширных исследований стратегий устойчивости и морфологических изменений.  Пористость клеточной стенки Klebsiella variicola определяет эффективную адсорбцию ионов металлов Ni(II) и Co(II) [6]. Эта пористость дает больше информации о селективной проницаемости тяжелых металлов и перспективах биосорбции. Поэтому необходимо более глубоко изучать морфологические изменения стрессоустойчивости. Уменьшение размера клеток, вызванное нитратом свинца, наблюдалось у штамма Pseudomonas aeruginosa 4EA [3]. Аналогичным образом, Pantoea aglomeran при определенных концентрациях ионов металлов, включая Hg, Cu, Ag, As, Pb, Cr и Cd, образовывает нерегулярные гигантские клетки, удлиненные, укороченные цепи, морфологические нарушения клеточных мембран [7]. Следовательно, клеточные профили микроорганизмов, основанные на растяжении или сжатии, будут иметь важное значение для последующей оценки потенциала биоремедиации и биоаккумуляции. Поскольку, для улучшения трансформации на основе клеточной поверхности уменьшенная клеточная поверхность бактерий связана с диффузным накоплением ионов [8]. Более низкие концентрации металла влияют на его морфологические и физиологические изменения, которые невозможно обнаружить при более высоких концентрациях [10]. Морфологически измененный размер, форма или биохимические свойства клеток – это стратегии, основанные на специфическом адаптивном иммунитете к экологическим последствиям токсичности металлов. Детоксикация тяжелых металлов помимо морфологических изменений клеток, требует тщательного анализа, такого как селективность, специфичность и восприимчивость, в отношении типа тяжелых металлов, концентрации и т.д. Таким образом, нормальная флора загрязненных экосистем часто подвергается различным стрессам, особенно воздействию токсичных тяжелых металлов; однако литературных данных об изучении влияния этих металлов на морфологию и физиологию бактерий очень ограничено.

Исходя из вышесказанного, целью настоящего исследования является изучение морфологических и биохимических свойств бактерий, выделенных из почв, загрязненных тяжелыми металлами, в стрессовых условиях, вызванных тяжелыми металлами.

Материалы и методы исследования

Объекты исследования и условия выращивания: в предыдущих исследованиях был проведен скрининг более 50 новых изолятов выделенных в чистые культуры из почв загрязненных тяжелыми металлами Самаркандской и Кашкадарьинской областей по жизнеспособности и резистентности к различным ионам тяжелых металлов [10, 11]. По результатам скрининга в качестве объекта исследования были отобраны местные штаммы с высокой устойчивостью к тяжелым металлам:.Enterobacter cloacae 15, Enterobacter ludwigii 11, Pseudomonas aeruginosa 18, Bacillus licheniformis 10, Bacillus megaterium MK, Bacillus pumilis 3, Bacillus atropheus 4. Были определены морфологические и культуральные свойства изолированных чистых культур под действием тяжелых металлов.  Культуры выращивали на пептонном агаре с добавлением различных концентраций катионов тяжелых металлов никеля, кадмия  и меди, г/л: L-глюкоза –10;  K₂HPO₄  –  0,5;  MgSO₄ × 7H₂O  –  0,5; NaCl – 0,5; пептон – 5; agar – 18. Соли тяжелых металлов NiSO4 × 7H₂O; CdCl₂ × 2,5H₂O и CuSO₄ × 5H₂О в состав питательной среды добавляли в следующих концентрациях: 57,3 мг/л, 95,7 мг/л, 191,4 мг/л;  2,44 мг/л,  8,2 мг/л, 24,6 мг/л  и  59,0 мг/л, 118,0 мг/л, 354,0 мг/л, соответственно. В качестве контрольного варианта служила питательная среда без добавления ионов тяжелых металлов. Культуры выращивали в инкубаторе-термостате (Binder, Германия) при 30 °C в течение 2-3 cут.

Определение морфолого-культуральных и биохимических свойств микроорганизмов: культуральные свойства бактерий с высокой жизнеспособностью и устойчивостью к различным концентрациям никеля, кадмия и меди наблюдали с помощью ручного увеличительного стекла, а морфологические свойства бактерий наблюдали с помощью традиционного окрашивания по Грамму под микроскопом LEICA DM 1000 (Германия) [12]. Влияние тяжелых металлов на активность некоторых ферментов у толерантных к металлам штаммов в присутствии ионов тяжелых металлов Cu(II), Cd(II) и Ni(II) в составе питательной среды в концентрации 118,0 мг/л,  8,2 мг/л и 191,41 мг/л, соответственно, биохимические свойства оценивали с помощью тестов на каталазы, оксидазы, гидролиза желатина, амилазы, уреазы, нитратредуктазы, а также усвоение углеводов таких как глюкоза, сахароза, рамноза, манноза и лактоза [13].

Результаты и их обсуждение

Наличие в окружающей среде ионов тяжелых металлов могут вызывать изменения в структуре и функциях микробных сообществ и клеток [14]. Изменение морфолого-культуральных признаков бактерий зависит от типа, концентрации и времени воздействия тяжелых металлов. Для каждого вида бактерий характерна индивидуальная изменчивость в условиях загрязнения тяжелыми металлами.

В проведенных исследованиях было отмечено, что в контрольном варианте у штамма Bacillus licheniformis 10 цвет колоний был кремовый, блестящий, поверхностная часть слегка выпуклая, края неравномерно волнистые, диаметр 30-35 мм. А под действием концентрации никеля 95,7 мг/л наблюдается уменьшение колоний в диаметре (25-30 мм), поверхность колоний бледная, морщинистая, края приобретают ризоидную форму, в то время как при концентрации меди 59 мг/л колонии культуры имеют бесцветную, слегка выпуклую, гладкую прозрачную поверхность, в виде капли воды, края волнообразная, размер колоний составляет 18-20 мм. Таким образом, в клеточном строении Bacillus licheniformis 10 в результате действия исследуемых ионов тяжелых металлов наблюдается следующие морфологические изменения по отношению к контролю: в присутствии ионов никеля уменьшается размер клеток,  под действием ионов кадмия уменьшается объем клеток в 5-6 раз, а при действии ионов меди клетки теряют палочковидные формы, и при этом находятся в адгезивно-концентрированном состоянии слегка вытянутой формы (рис.1).

Показано, что у штамма Pseudomonas aeruginosa 18 с увеличением концентрации ионов Cd²⁺ размер колоний уменьшается, а при воздействии ионов Cu²⁺ увеличивается, в то же время при действии ионов Ni²⁺ остается неизменным. Также были обнаружены наблюдаемые изменения в размерах клеток.

Рисунок 1. Рост и развитие Bacillus licheniformis 10: 1, 2, 3  – контроль (общий вид колоний и клеток),  4, 5, 6 – при концентрации никеля 95,7 мг/л; 7, 8, 9 - при концентрации кадмия 4,1 мг/л;  10, 11,12 – при концентрации меди 59 мг/л  (Увеличение: 10 x 100)

При раздельном воздействии различных металлов на клетки наблюдались некоторые морфологические изменения клеток. Следует отметить, что в контрольном варианте клетки Pseudomonas aeruginosa 18 имеют отдельно расположенные палочковидные формы достигая в длину 1,0-1,5 мкм и ширину 0,4-0,7 мкм. В то же время в присутствии в составе питательной среды исследуемых ионов тяжелых металлов наблюдается некоторые изменения в морфологии клеток. Например, при воздействии Cu²⁺ размер клеток увеличивается в 1,5-2 раза к контролю. А при действии ионов Cd²⁺ и Ni²⁺ размер клеток P. aeruginosa 18 уменьшается, и образовывают длинные палочковидные цепи.

В проведенных исследованиях выявлено значительные морфолого- культуральные изменения у резистентных штаммов Enterobacter cloacae 15, Enterobacter ludwigii 11, Bacillus megaterium MK, Bacillus pumilis 3, Bacillus atropheus 4 под действием ионов Cd²⁺. Согласно полученным результатам, по мере увеличения концентрации ионов Cd²⁺ наблюдается уменьшение диаметра и изменение формы колоний по сравнению с контрольной группой. Так, при концентрации Cd²⁺ - 4,1 мг/л и 8,2 мг/л наблюдалось увеличение размера клеток в 5-6 и 2-3 раза, соответственно, а при концентрации металла 24,6 мг/л размер клеток уменьшается практически в 2 раза к контролю. У культуры Enterobacter ludwigii 11 размер клеток уменьшается с увеличением концентрации никеля в среде культивирования, а у штамма Bacillus atropheus 4 размер клеток увеличивается в 5-6 раз при концентрации никеля 95,7 мг/л. В то же время выявлено, что у штамма Bacillus atropheus 4 при наиболее высоких концентрациях никеля 191,4 и 574,2 мг/л размер клеток остается на уровне контрольных вариантов (3-5×0,4-0,5 мкм). Известно, что бактерии используют различные стратегии для адаптации к условиям окружающей среды, включая воздействие высоких концентраций тяжелых металлов. Одна из стратегий, с помощью которой бактерии приспосабливаются к стрессовым условиям – это изменение своей морфологии. Такие изменения происходят под действием металлоидных оксианионов у фототрофных бактерий, а также у Pseudomonas putida и Enterobaster sp. токсичных органических соединений [15].

Далее, при воздействии ионов тяжелых металлов Ni²⁺, Cd²⁺, Cu²⁺ в концентрации 191,41 мг/л; 8,2 мг/л; 118,0 мг/л была изучена активность некоторых ферментов у исследуемых культур (табл.). Согласно полученным результатам, у местных штаммов бактерий не наблюдается значительных изменений в активности ферментов в результате действия ионов Cu²⁺ по сравнению с контролем. Однако при воздействии ионов Ni²⁺ и Cd²⁺ было обнаружено некоторые изменения в активности ферментов амилазы, оксидазы, желатиназы по сравнению с контролем. Например, в контрольном варианте активность амилазы и оксидазы у штаммов B. pumilis 3 и E. Cloacae 15 отрицательная, а при действии ионов Cd²⁺ положительная.

Таблица 1.

Некоторые биохимические свойства бактерий при действии тяжелых металлов

Примечание “ – ” - отрицательный результат, " + " - положительный результат

У штаммов B. licheniformis 10 и E. ludwigii 11 в контрольном варианте активность амилазы и оксидазы отрицательная, а при действии ионов Ni²⁺ и Cd²⁺ положительная, в то же время у штамма B. atropheus 4 активность амилазы в контрольном варианте отрицательная, а при действии ионов Cd²⁺ положительная (табл.).  В частности, в исследованиях Li и др., (2015) показано, что тяжелые металлы могут взаимодействовать с комплексом фермент-субстрат в качестве загрязняющих веществ, денатурируя фермент или вмешиваясь в активные центры белков, что приводит к ослаблению активности некоторых ферментов [16].

В частности, в проведенных исследованиях было замечено, что при ферментации углеводов бактериями также происходят изменения, вызванные действием тяжелых металлов (рис.2). Например, у штамма P. aeruginosa 18 наблюдается ферментация глюкозы, сахарозы, маннозы, в то время как у штамма E. cloacae 15 в контрольном варианте наблюдается положительные результаты при ферментации рамнозы, лактозы, и отрицательные под действием ионов Cd²⁺ (рис.2).

Рисунок 2. Бактерии, выращенные в среде Гисса в течение 5 сут:  А-контроль; Б – при концентрации катионов Ni - 95,7 мг/л; С- при концентрации Cd -  4,1 мг/л; 1-3-Pseudomonas aeruginosa 18; 4-6-Enterobacter cloacae 15; 7-9-Bacillus pumilis 3

В литературных источниках основной причиной изменения морфологии и физиологии бактерий под действием тяжелых металлов называют нарушение функции ферментов дыхательной цепи, а также свойств мембраны, необходимых для синтеза АТФ, и повреждение внутренних транспортных систем клетки. Однако синтез РНК и белка ингибируется, что приводит к тому, что тяжелые металлы могут оказывать мутагенное действие на микроорганизмы [14].

Заключение

Усиление урбанизации и индустриализации привело к увеличению загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами, изменив структуру и функции микробных сообществ. Способность микроорганизмов выживать в стрессовых условиях, например, в присутствии тяжелых металлов, обусловлена их морфологическими и биохимическими особенностями, а также физиологическими и генетическими адаптациями. Проведенные исследования показали, что стрессовые реакции на тяжелые металлы у разных бактерий проявляются по-разному. Например, при действии катионов Ni²⁺ и Cd²⁺ наблюдалось уменьшение размера колоний и клеток у штамма Enterobacter ludwigii 11 по сравнению с контролем, в то время как при действии ионов Cu²⁺ наблюдалось увеличение этих параметров. Также были обнаружены изменения, в активности ферментов и углеродной ферментации у штаммов Bacillus pumilis 3, Enterobacter cloacae 15, Bacillus licheniformis 10 и Enterobacter ludwigii 11, которые были отобраны как штаммы с высокой устойчивостью и жизнеспособностью к стрессу тяжелых металлов. Таким образом, местные штаммы микроорганизмов резистентные к высоким концентрациям ионов тяжелых металлов послужит основой в качестве экологических объектов при осуществлении биоремедиации и биотрансформации тяжелых металлов. Так как биоремедиация относится к использованию микроорганизмов для разложения загрязняющих веществ, представляющих опасность для окружающей среды и человека. Процессы биоремедиации обычно включают действия многих различных микробов, действующих параллельно или последовательно для завершения процесса деградации. Способность микробов разлагать широкий спектр загрязняющих веществ делает биоремедиацию технологией, которую можно применять в различных почвенно-климатических условиях.

Список литературы:

1. P.B. Tchounwou, C.G. Yedjou, A.K. Patlolla, D.J. Sutton. Heavy metal toxicity and the environment.  Mol. Clin. Environ. Toxicol., 101 (2012), pp. 133-164
2. K. Mathivanan, R. Rajaram, Isolation and characterisation of cadmium-resistant bacteria from an industrially polluted coastal ecosystem on the southeast coast of India. Chem. Ecol., 30 (2014), pp. 622-635
3. M.M. Naik, S.K. Dubey. Lead-enhanced siderophore production and alteration in cell morphology in a Pb-resistant Pseudomonas aeruginosa strain 4EA. Curr. Microbiol., 62 (2011), pp. 409-414
4. R. Antony, P.P. Sujith, S.O. Fernandes, P. Verma, V.D. Khedekar, P.A.L. Bharath. Cobalt immobilization by manganese oxidizing bacteria from the Indian Ridge System. Curr. Microbiol., 62 (2011), pp. 840-849
5. K. Mathivanan, R. Rajaram, V. Balasubramanian. Biosorption of Cd (II) and Cu (II) ions using Lysinibacillus fusiformis KMNTT-10: equilibrium and kinetic studies. Desalin. Water Treat., 57 (2016), pp. 22429-22440
6. A.M. Afzal, M.H. Rasool, M. Waseem, B. Aslam. Assessment of heavy metal tolerance and biosorptive potential of Klebsiella variicola isolated from industrial effluents. AMB Express, 7 (2017), pp. 1-9
7. B.V. Mohite, S.H. Koli, S.V. Patil. Heavy metal stress and its consequences on exopolysaccharide (EPS)-producing Pantoea agglomerans. Appl. Biochem. Biotechnol., 186 (2018), pp. 199-216
8. R. Chakravarty, P.C. Banerjee. Morphological changes in an acidophilic bacterium induced by heavy metals. Extremophiles, 12 (2008), pp. 279-284
9. I. Ahmad, S. Hayat, A. Ahmad, A. Inam. Effect of heavy metal on survival of certain groups of indigenous soil microbial population. J. Appl. Sci. Environ. Manag., 9 (2005), pp. 115-121.
10.  Usmonqulova A.A., Atadjanova Sh.Sh., Narmuhammedova M.K. Issledovaniye rezistentnosti bakteriy k kationam Cd, Cu, Ni i Cr. Nauchnyy zhurnal “Vestnik molodykh uchenykh”, №2(4) 2022. S.153-158.
11. Кадырова Г.Х, Усманкулова А.А, Закирьяева С.И, Каримов Х.Н, Пайзиллоев А.К, Атаджанова Ш.Ш. Скрининг устойчивых к ионам тяжелых  металлов почвенных микроорганизмов. Universum 2021, №12(90), C 11-18.
12.  Bartholomew, J.W. Variables influencing results, and the precise definition of steps in gram staining as a means of standardizing
    the results obtained. Stain Technol. 1962, 37, 139–155.
13.  Г.И.Чубенко. Методы идентификации бактерий. Методическое пособие для самоподготовки студентов/ Благовещенск, 2018.
14. Doelman P, Jansen E, Michels M, Van TM. Effects of heavy metals in soil on microbial diversity and activity as shown by sensitivity-resistance index, an ecologically relevant parameter. Biology and Fertility of Soils. 1994; 17:177-184.
15. Neumann, G., Veeranagouda, Y., Karegoudar, T.B., Sahin Ö., Mäusezahl I., Kabelitz N., Kappelmeyer U., Heipieper Hermann J. Cells of Pseudomonas putida and Enterobacter sp. adapt to toxic organic compounds by increasing their size. Extremophiles 2005, 9, P.163–168.
16. Xiaofang Li, Fang You, Philip L. Bond, Longbin Huang, Establishing microbial diversity and functions in weathered and neutral Cu–Pb–Zn tailings with native soil addition, Geoderma, 2015, Volumes 247–248, P.108-116.