СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ФИТОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ И АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ ЭКСТРАКТОВ Crataegus pontica, Gnaphalii uliginosi herba, Leonurus turkestanicus

АННОТАЦИЯ

В статье изложены результаты сравнительного фитохимического анализа экстрактов плодов Crataegus pontica, надземной части Gnaphálium uliginósi herba, надземной части Leonurus turkestanicus. Во всех экстрактах были обнаружены флавоноиды, полифенолы, сапонины, танины. В ходе исследования определено содержание флавоноидов в экстракте: Crataegus pontica – 33,1±1, мг/г, Leonurus turkestanicus – 58,73±2,9 мг/г, Gnaphálium uliginósi herba – 21,7±1,1 мг/г сухого веса в пересчёте на рутин.  Содержание фенолов  в экстрактах:  Crataegus pontica – 246,03±12, мг/г,  Leonurus turkestanicus – 244,92±12,2 мг/г, в Gnaphálium uliginósi herba – 169,98±8,5 мг/г  в пересчете на галловую кислоту.  Содержание танинов в экстрактах: Crataegus pontica – 242,21±12 мг/г,  Leonurus turkestanicus – 323,50±16 мг/г,  Gnaphálium uliginósi herba – 240,83±12,0 мг/г сухого веса в пересчёте  на  эпигаллокатехин.  Содержание сапонинов  в экстрактах : Crataegus pontica – 0,045±0,0022 мг/г, Leonurus turkestanicus – 0,769±0,04 мг/г,  Gnaphálium uliginósi herba – 0,054±0,0032 мг/г  в  пересчете   на глицирризиновую кислоту. Суммарное содержание антиоксидантов в экстрактах: Crataegus pontica – 196,94±15,124 мг/г, Leonurus turkestanicus – 269,11±25,83 мг/г,  Gnaphálium uliginósi herba – 150,24±11,22 мг/г.

ABSTRACT

The article presents the results of a comparative phytochemical analysis of fruit extracts of Crataegus pontica, the aerial part of Gnaphálium uliginosi herba, and the aerial part of Leonurus turkestanicus. Flavonoids, polyphenols, saponins, tannins were found in all extracts. During the study, the content of flavonoids in the extract was determined: Crataegus ponticа – 33.1±1, mg/g, Leonurus turkestanicus – 58.73±2.9 mg/g, Gnaphálium uliginósi herba – 21.7±1.1 mg/g dry weight in terms of rutin. The content of phenols in extracts: Crataegus pontica – 246.03±12, mg/g, Leonurus turkestanicus – 244.92±12.2 mg/g, in Gnaphálium uliginósi herba – 169.98±8.5 mg/g in terms of gallic acid). The content of tannins in the extracts: Crataegus pontica – 242.21±12 mg/g, Leonurus turkestanicus – 323.50±16 mg/g, Gnaphálium uliginósi herba – 240.83±12.0 mg/g dry weight in terms of epigallocatechin. The content of saponins in extracts of Crataegus pontica – 0.045±0.0022 mg/g, Leonurus turkestanicus – 0.769±0.04 mg/g, Gnaphálium uliginósi herba – 0.054±0.0032 mg/g in terms of (glycyrrhizic acid). The total content of antioxidants in the extracts: Crataegus pontica – 196.94±15.124 mg/g, Leonurus turkestanicus – 269.11±25.83 mg/g, Gnaphálium uliginósi herba – 150.24±11.22 mg/g.

Ключевые слова: лекарственные растения, вторичные метаболиты, свободные радикалы, антиоксиданты .

Keywords: medicinal plants, secondary metabolites, free radicals, antioxidants

Присутствие аактивных форм кислорода (АФК) в организме человека является как результатом нормального клеточного метаболизма, так и результатом негативного воздействия факторов окружающей среды. Окислительный стресс отражает смещение баланса между оксидантами и антиоксидантами в пользу оксидантов и способствует развитию многих патологических состояний и заболеваний, включая рак, неврологические расстройства, атеросклероз, гипертонию, ишемию/перфузию, диабет и др. Регуляция восстановительного и окислительного состояния имеет решающее значение для жизнеспособности клеток, активации, пролиферации и функции органов. В настоящее время в качестве перспективных антиоксидантов рассматриваются вещества растительного происхождения, поскольку они обладают малой токсичностью, а также и могут применяться как в терапии, так и при заболеваниях, а также в программе реабилитации [1]. Безусловно, фитопрепараты не всегда могут заменить синтетические препараты, но они практически всегда могут использоваться в комплексной терапии, поскольку обладают хорошей совместимостью с синтетическими препаратами, мягкостью терапевтического действия, отсутствием привыкания и отсутствием выраженных побочных эффектов. При их разумном сочетании можно существенно повышать терапевтический эффект лечения [2].

На сегодняшний день заболевания сердечно-сосудистой системы являются наиболее распространённой патологией в мире. Согласно статистике Всемирной Организации Здравоохранения за последние 10 лет смертность от ишемической болезни сердца среди населения в возрасте от 35 до 45 лет возросла на 60%, при этом большее распространение наблюдается среди мужчин. Также вследствие возрастающего экологического, инфекционного, социального прессинга отмечается существенное снижение резистентности организма, связанное с ослаблением детоксикационных, иммунных и других адаптационно-приспособительных механизмов.

На сегодняшний день в Узбекистане разрешено использовать в медицине 112 видов лекарственных растений. Около 80% из них являются естественно растущими растениями, однако в последние годы все чаще появляются большие площади искусственных плантаций. В арсенале народной медицины Узбекистана используется много растений, которые положительно воздействуют на сосуды и сердечную мышцу. Кроме этого, они могут оказать вспомогательное терапевтическое действие, если заболевание уже развилось и прогрессирует в организме.

Целью данной работы явился предварительный фитохимический и антиоксидантный скрининг экстрактов лекарственных растений, широко применяемых в народной медицине для профилактики сердечно-сосудистых заболеваний, а именно из плодов Crataegus pontica и из надземной части Leonurus turkestanicus и Gnaphálium uliginósi herba,

Материалы и методы

Лекарственные экстракты плодов Crataegus pontica, надземной части Leonurusturkestanicus , Gnaphálium uliginósi herba были предоставленны фирмой “ООО Биотон”.  Все используемые реагенты были местного производства, квалификации  хч, чда и/или соответственно ГОСТ.

Сухие экстракты Herba leonuri, Gnaphalii uliginosi herba, Crataegus pontica  разводили в дистиллированной воде в концентрации 5 мг/мл, а затем анализировали на присутствие флавоноидов [3], углеводов [4], сапонинов [5], фенолов [6], белков [7], терпеноидов (стероидов) [8], алкалоидов [9], дубильных веществ [9] и гликозидов [10] согласно общепринятым методикам.

Для количественного анализа содержания вторичных метаболитов в исследованных экстрактах был применён метод прямой спектрофотометрии. Измерение оптической плотности образцов производили по отношению к растворителю. В качестве эталона использовали калибровочную кривую стандартного образца (СО) сравнения с известной концентрацией вещества и подчиняющуюся закону Бугера—Ламберта—Бера. Расчёт вели в пересчете на СО тин и абсолютно сухое сырье в мгр/гр или мкгр/гр (Х) по формуле:

,

где  Dx  –  оптическая  плотность испытуемого раствора; D₀  –  оптическая  плотность  раствора СО; m – масса сырья в граммах; m₀ – масса СО в граммах. Общее содержание флавоноидов (ОСФ) определяли методом хлорида алюминия согласно [11]. Рутин использовали в качестве стандарта для построения калибровочной кривой, а результаты выражали в эквивалентах рутина (мг рутина/г сухого экстракта). Общее содержание сапонинов (ОСС) определяли методом, основанным на ванилин-сернокислотной колориметрической реакции согласно [12]. Глицирризиновую кислоту (ГК) использовали в качестве стандарта для построения калибровочной кривой, а результаты выражали в эквивалентах глизирризиновой кислоты (мг глицирризовой кислоты/г сухого экстракта). Общее содержание полифенолов (ОСП) определяли согласно [13]. Галловую кислоту использовали в качестве стандарта для построения калибровочной кривой, а результаты выражали в эквивалентах галловой кислоты (мг галловой кислоты/г сухого экстракта). Общее содержание танинов (ОСТ) определяли по методике, описанной [14]. Эпигаллокатехин использовали в качестве стандарта для построения калибровочной кривой, а результаты выражали в эквивалентах эпигаллокатехина (мг эпигаллокатехина/г сухого экстракта). Суммарное содержание антиоксидантов фосфомолибденовым методом (ССА) определяли согласно [15]. Суммарное содержание антиоксидантов определяли по коэффициенту молярной экстинкции образцов на основании калибровочной кривой аскорбиновой кислоты.

Антирадикальная активность в условиях in vitro проводили, согласно методике, стандартным методом измерения кинетики оптической плотности спиртового раствора свободного радикала ДФПГ [16]. Антиоксидантную активность определяли путём ингибирования NO радикала  согласно методике [17] и по общепринятому методу FRAP [18].

Статистическая обработка проводилась применением пакета прикладных программ Origin 8.0 (США) с вычислением среднеарифметической величины (М), среднего квадратичного отклонения (у), средней ошибки среднеарифметической величины (m), критерия Стьюдента (t) с вычислением вероятности ошибки (Р). За статистически значимые изменения принимали уровень достоверности P<0,05.

Результаты и обсуждение

С помощью качественных химических реакций был установлен фитохимичский состав полученных экстрактов Herba leonuri, Gnaphalii uliginosi herba, Crataegus pontica. Результаты представлены в таблице 1.  

Таблица 1. 

Фитохимический скрининг полученных экстрактов
(«+» - присутствует, «-» - отсутствует)

Как видно из таблицы 1 основными компонентами полученных экстрактов были флавоноиды, сапонины, полифенолы и танины. В связи с этим далее был проведен количесвенный анализ данных вторичных метаболитов.

Общее содержание флавоноидов, сапонинов, полифенолов и танинов в экстрактах представлено в таблице 2.

Таблица 2.

Общее содержание флавоноидов, полифенолов и танинов (показатель эффективности экстракта представлен эквивалентом соответствующего стандартного соединения)

Общее содержание флавоноидов варьировало от максимального 58.73±2,9 мг/г у пустырника до минимального 21,7±1,1 мг/г, выраженное в эквивалентах рутина, галловой кислоты. Наибольшее содержание сапонинов наблюдалось у Leonurus turkestanicus 0,769±0,04 мг/г, наименьшее у Crataegus pontica 33,1±1,7 мг/г, выраженное в эквивалентах глицирризиновой кислоты. При этом экстракты Crataegus pontica и Leonurus turkestanicus показали близкие значения содержание полифенолов 246,03±12,3 мг/г и 244,92±12,2 мг/г, соответственно, в эквивалентах галловой кислоты. Высокое содержание танинов зафиксировано у экстракта Leonurus turkestanicus 323,50±16,2 мг/г в эквивалентах эпигаллокатехина.   Было обнаружено, что общее содержание полифенолов и флавоноидов во всех экстрактах разумно коррелирует с общим суммарным содержанием антиоксидантов. Высокое содержание фенольных соединений указывало на то, что эти соединения ответственны за антиоксидантную активность. Таким образом, исследованные экстракты можно рассматривать как перспективные кандидаты на роль природных растительных источников антиоксидантов.

Таблица 3.

Антирадикальная  и антиоксидантная активность экстрактов

В таблице 3 представлены результаты антиоксидантной и антирадикальной активности экстрактов, полученные с помощью ДФПГ и NO радикалов, а также методом FRAP.

Так, кинетические кривые ингибирования радикала ДФПГ всеми экстрактами показали, что большая часть молекул ДФПГ восстанавливается в первые 3 минуты реакции, в дальнейшем реакция восстановления проходит более медленно. Величина констант химической реакции первой степени может служить критерием антирадикальной эффективности полифенолов. Как видно из таблицы 3 значение константы антирадикальной активности наиболее высокое у экстракта Crataegus pontica. При этом, у данного экстракта наиболее низкой значение ингибирования NO радикала, тогда как наиболее высокое наблюдалось у Leonurus turkestanicus - IC₅₀ 4,0±0,018 мг/мл и 5,8±0,015 мг/мл, соответственно. Способность экстрактов ингибировать NO-радикал способствует обрыву цепи реакций, приводящих к различным патогенным нарушениям, включая воспалительные процессы, инсульт и др. заболевания кишечника, сепсис и септический шок, первичные головные боли и инсульт [19]. Кроме того, все больше данных указывают на то, что избыток NO радикалов вызывает повреждение и гибель клеток при сердечно-сосудистых заболеваниях [20]. Потенциальная активность экстрактов ингибировать формирование NO радикалов может способствовать их использование для профилактики сердечно-сосудистых расстройств.

Выводы: в иследовнии были изучены лекарственные экстракты, применяемые в народной медицине при лечении и профилактике сердечно-сосудистых заболеваний. Такие как,Crataegus pontica, Leonurus turkestanicus , Gnaphálium uliginósi herba. Определено содержание флавоноидов в экстракте: Crataegus pontica – 33,1±1, мг/г, Leonurus turkestanicus – 58,73±2,9 мг/г, Gnaphálium uliginósi herba – 21,7±1,1 мг/г сухого веса в пересчёте на рутин. Содержание фенолов в экстрактах:  Crataegus pontica – 246,03±12, мг/г,  Leonurus turkestanicus – 244,92±12,2 мг/г, в Gnaphálium uliginósi herba – 169,98±8,5 мг/г  в пересчете на галловую кислоту.  Содержание танинов в экстрактах: Crataegus pontica – 242,21±12 мг/г,  Leonurus turkestanicus – 323,50±16 мг/г,  Gnaphálium uliginósi herba – 240,83±12,0 мг/г сухого веса в пересчёте  на  эпигаллокатехин.  Содержание сапонинов  в экстрактах : Crataegus pontica – 0,045±0,0022 мг/г, Leonurus turkestanicus – 0,769±0,04 мг/г,  Gnaphálium uliginósi herba – 0,054±0,0032 мг/г  в  пересчете   на глицирризиновую кислоту. Суммарное содержание антиоксидантов в экстрактах: Crataegus pontica – 196,94±15,124 мг/г, Leonurus turkestanicus – 269,11±25,83 мг/г,  Gnaphálium uliginósi herba – 150,24±11,22 мг/г. Исследование антиоксидантной и антирадикальной активности экстрактов, показало, что экстракты, Crataegus pontica, Leonurus turkestanicus и Gnaphálium uliginósi herba можно рассматривать как перспективные, природные растительные источники антиоксидантов.

Список литературы:

1. Шур Ю.В., Шур В.Ю., Самотруева М.А. Некоторые механизмы иммунотропного и адаптогенного действия фитопрепаратов // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. - 2019. - Т. 17. - №4. -C.19-29.doi:10.17816/RCF17419-29P.9–19. https://doi.org/10.1097/WOX.0b013e3182439613
2. Самбукова Т.В., Овчинников Б.В., Ганапольский В.П., Ятманов А.Н., Шабанов П.Д. Перспективы использования фитопрепаратов в современной фармакологии // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии.-2017.-Т.15.-№2.-C.56-63. doi: 10.17816/RCF15256-63
3. Onwukaeme D.N., Ikuegbvweha T.B., Asonye C.C. (2007). Evaluation of Phytochemical Constituents, Antibacterial Activities and Effect of Exudate of Pycanthus Angolensis Weld Warb (Myristicaceae) on Corneal Ulcers in Rabbits. // Tropical Journal of Pharmaceutical Research (ISSN: 1596-5996) V.6. – Num. 2.6.
4. Dwivedi A., Argal A. (2017). Extraction and Preliminary Phytochemical Screening of Leaves and Seeds of Abelmoschus Moschatus Medik. // American Journal of Life Science Researches, V.5. – I.3. – P.126-129. doi:10.21859/ajlsr-05038
5. Parekh J., Chanda S.V. (2007).In vitro antimicrobial activity and phytochemical analysis of some Indian medicinal plants. // Turk Journal Biology. V.31. – P.53–58.
6. Bulgariu L., Georgiana A., Ichim T., Radu V., (2018). Simple and rapid spectrophotometric method for phenol determination in aqueous media. // Bulletin of the Polytechnic Institute of Jassy, CONSTRUCTIONS. ARCHITECTURE Section 64. – P. 9-18.
7. Gupta Sh., Kohli S. (2010). Phytochemical Screening of Sarcostigmma acidum. International Journal Pharmacy and Life Science. V.1. – I.3. – P.170-173.
8. Edeoga H.O., Okwu D.E., Mbaebie B.O. (2005). Phytochemical constituents of some Nigerian medicinal plants. // African Journal Biotechnology. V.4 – P.685–688
9. Kumar S., Singh B.B., Kumar N. (2014). Physico-chemical and phytochemical investigation of plant Sesbania sesban. // Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. V.5. – P.110-117
10. Parekh J., Chanda S.V. (2007). In vitro antimicrobial activity and phytochemical analysis of some Indian medicinal plants. // Turk Journal Biology. V.31. – P. 53–58
11. Kamtekar S., Keer V., Patil V. (2014). Estimation of phenolic content, flavonoid content, antioxidant and alpha amylase inhibitory activity of marketed polyherbal formulation. // Journal of Applied Pharmaceutical Science. V.4. – P. 61-65. 10.7324/JAPS.2014.40911
12. Senguttuvan J., Paulsamy S., Karthika K. (2014). Phytochemical analysis and evaluation of leaf and root parts of the medicinal herb, Hypochaeris radicata L. for in vitro antioxidant activities. // Asian Pacific journal of tropical biomedicine. V.4. – P. 359–S367. https://doi.org/10.12980/APJTB.4.2014C1030
13. Lamuela-Raventós., Rosa M. (2017). Folin-Ciocalteu method for the measurement of total phenolic content and antioxidant capacity: Recent Trends and Applications. 10.1002/9781119135388.ch6
14. Wahab A., Jan S.A., Rauf A., Rehman Z.U., Khan Z., Ahmed A., Syed F., Safi S.Z., Khan H., Imran M. (2018). Phytochemical composition, biological potential and enzyme inhibition activity of Scandix pecten-veneris L. // Journal of Zhejiang University. Science. B. – V.19(2). – P.120–129. https://doi.org/10.1631/jzus.B1600443
15. Hanafey F. Maswada , (2013). Assessment of total antioxidant capacity and antiradical scavenging activity of three Egyptian wild plants. // Journal of Medical Sciences, V.13 – P. 546-554. DOI: 10.3923/jms.2013.546.554
16. Gayibova S., Ivanišová E., Ãrvay, J., Hŕstková M., Slávik M., Hleba L., Tóth T., Kačániová M., Aripov, T. (2019). In vitro screening of antioxidant and antimicrobial activities of medicinal plants growing in Slovakia. // Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences. V.8. – I.6 -  P.1281–1289. https://doi.org/10.15414/jmbfs.2019.8.6.1281-1289
17. Khanbabaee K., Ree T. (2001). Tannins: Classification and Definition. // National Product Reports. V.18 - P. 641-649.
18. Vijayalakshmi M., Ruckmani K. (2016). Ferric reducing anti-oxidant power assay in plant extract. // Bangladesh Journal of Pharmacology. V.11. – P. 570.
19. Shama J.N., Al-Omran A., Parvathy S.S. (2007) Role of nitric oxide in inflammatory diseases. // Inflammopharmacology. V.15 – I.6. – P. 252–259. doi: 10.1007/s10787-007-0013-x.
20. Nieminen A. L. Apoptosis and necrosis in health and disease: role of mitochondria. Int Rev Cytol. 2003; 224: 29—55.