МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПОРАЖЕННЫХ РЫБ, ВЫРАЩИВАЕМЫХ В УСЛОВИЯХ СОВРЕМЕННОГО РЫБОВОДСТВА УЗБЕКИСТАНА

АННОТАЦИЯ

Проведен микробиологический анализ внутренних органов и жабер пораженных рыб, а также воды из пруда одного из рыбхозов Чиназского района (Узбекистан). Исследования выявили значительное обсеменение внутренних органах рыб до 18х10⁶ КОЕ/мл микроорганизмами, растущими на среде МПА, также выявлены микроорганизмы, растущие на среде Гильтая – до 10² - 10³ КОЕ/мл. В исследованных образцах рыбы и воды выявлена контаминация агентами, относящимися к грамотрицательной ферментирующей микрофлоре, сапрофитной и условно патогенных рас. На долю грамотрицательной неферментинующей микрофлоры приходилось значительное количество, это разнородные группы не образующих споры бактерий. Выделены чистые культуры микроорганизмов, идентифицированные как Aeromonas veronii и Pseudomonas fluorescens. Показано подавление роста Aeromonas veronii при применении стрептомицина, канамицина и эритромицина. В меньшей степени линкомицина.

ABSTRACT

A microbiological analysis of the internal organs and gills of affected fish, as well as water from the pond of one of the fish farms in the Chinaz region (Uzbekistan) was carried out. Studies have revealed a significant semination of the internal organs of fish up to 18x10⁶ CFU/ml with microorganisms growing on the MPA, and microorganisms growing on the Giltai medium - up to 10² - 10³ CFU/ml. In the studied samples of fish and water, contamination with agents belonging to the gram-negative fermenting microflora, saprophytic and conditionally pathogenic races was revealed. The share of gram-negative non-enzymatic microflora accounts for a significant amount, these are heterogeneous groups of cultures that do not form spores. Pure cultures of microorganisms were isolated, identified as Aeromonas veronii and Pseudomonas fluorescens. Aeromonas veronii growth suppression has been shown with streptomycin, kanamycin, and erythromycin. To a lesser extent, lincomycin.

Ключевые слова: микроорганизмы, Aeromonas veronii, Pseudomonas fluorescens, рыбоводство, болезни рыб.

Keywords: microorganisms, Aeromonas veronii, Pseudomonas fluorescens, fish farming, fish diseases.

Введение

Снабжение населения полноценной белковой пищей одна из важных проблем, в решении которой большую роль играет интенсивное развитие прудового и озерного рыбоводства. Развитие аквакультуров различных районах Узбекистана вносит существенный вклад в увеличение рыбной продукции и в воспроизводство ценных видов промысловых рыб. Широкое распространение получило прудовое рыбоводство по выращиванию карпа, толстолобика, белого амура и других рыб. Это предусматривает максимальное зарыбление озер и водохранилищ, а также уплотненные посадки рыбы в выростных, нагульных и в зимовальных прудах и обуславливает тесный контакт. В связи с этим, возникают благоприятные условия для распространения инфекционных и инвазионных болезней. Таким образом, наращивание объемов производства и мощности неизменно сопровождаются ухудшением эпизоотического статуса и состояния здоровья объектов аквакультуры при отсутствии должного контроля за ними [5].

Развитие рыбоводных хозяйств и рост рыбопродуктивности прудов осуществляется за счет интенсификации отрасли (кормление рыбы искусственными кормами, удобрение прудов органическими и минеральными смесями, зеленой растительностью, внедрение поликультуры). При этом возникает неизбежная концентрация поголовья рыб на небольших площадях, вследствие чего количество воды и естественного корма на особь заметно уменьшается. Одновременно с этим накапливаются остатки концентрированных кормов, экскременты и другие продукты жизнедеятельности рыб. Все это ухудшает санитарное  состояние прудовых вод и способствует возникновению массовых поражений рыбинфекционными и инвазионными болезнями [1].

Вода вместе с грунтом ложа пруда с бактериями, водорослями, надводными и подводными высшими растениями, беспозвоночными кормовыми животными является средой обитания для рыб. Она влияет на все жизненные процессы, происходящие в организме рыбы: дыхание, питание, кроветворение и кровообращение, на нервную деятельность, размножение, рост и развитие. Поэтому для нормальной жизнедеятельности рыб и поддерживания на должном уровне жизнестойкости им необходимо создавать в прудах оптимальные зоогигиенические условия [3].

В настоящее время многие возбудители инфекционных и инвазионных болезней, считавшиеся ранее относительно безопасными и потому они являются малоизученными в условиях современного рыбоводства Республики, становятся патогенными и могут приносить большие убытки, поэтому они требуют скорейшего изучения.

Исходя из вышеизложенного нами были проанализированы пробы отобранные из пораженных предположительно псевдомонозом рыб толстолобиков и вода из пруда.

Материалы и методы.

Пробы отбирались из внутренних органов и жабр пораженных рыб, также была проанализирована вода из пруда одного из рыбхозов Чиназского района (Узбекистан).

Вскрытие рыбы, отбор проб и бакпосевы проводили в строго стерильных условиях на поверхностях, обработанных спиртом. Отбор проб проводили следующим образом: рыбу кладут на правый бок брюшной стороной к вскрывающему, голову и хвост фиксируют на доске препаровальными иглами. Левую сторону тела рыбы освобождают от слизи и чешуи, отрезают грудной и брюшной плавники, всю площадь бока протирают ватным тампоном, смоченным в спирте. Ножницами прокалывают брюшную стенку, несколько выше анального отверстия. Далее рыбу вскрывают дугообразно вперед и вверх к позвоночному столбу, а затем вперед и вниз к жаберной крышке за основание грудного плавника. Пинцетом убирают и удаляют брюшную стенку от анального отверстия до грудных плавников. Далее, прижигая места укола, на питательные среды делают высевы из внутренних органов: сердце, селезенка, почки и другие органы. Посевы из кишечника делаются в последнюю очередь [7].

Посев проводился на специализированные среды для выделения микроорганизмов рода Pseudomonas (мясо пептонный агар (МПА) и среду Гильтая).

Идентификацию полученных изолятов проводили на основании морфолого-культуральных и физиолого-биохимических свойств, а также с использованием масс-спектрометрического анализа (Malditof).

Чувствительность к антибиотикам устанавливали диско-диффузионным методом. Учитывали зоны отсутствия роста (мм) испытуемой газонной культуры вокруг дисков [4].

Результаты исследований

Анализ развития данных рыб показывают, что в исследуемых прудовыххозяйствах развиваются восновном толстолобики. Толстолобики или толстолобы (Hypophthalmichthys) – род пресноводных рыб семейства карповых. Английское название silver carp («серебряный карп»). Раньше он подразделялся на роды Hypophthalmichthys и Aristichthys в составе подсемейства Hypophthalmichthyinae. В роде три современных и один вымерший вид. Широкое распространение среди данного вида рыб имеют такие инфекционные болезни как: аэромоноз (краснуха), карпов (Aetomonas nyrophila), псевдомоноз карпов и толстолобиков (Pseudomonas cuprinisepticum, P.dermoalba), бронхиомикоз (Branchiomyces sanquinis) и другие. Эти болезни встречаются во многих хозяйствах из-за несвоевременного выполнения лечебно-профилактических, ветеринарно-санитарных и рыбоводно-мелиоративных мероприятий.

Псевдомонозы  –  общее название болезней карповых рыб, вызываемых бактериями из рода Pseudomonas. Типовой вид – Pseudomonas aeruginosa, являющийся сапрофитом, способен к временному паразитизму в организме животных, человека и растений.

Другие виды псевдомонад также широко распространены в окружающей среде и их причисляют к микробам-оппортунистам. У рыб, обитающих в пресных и солоноватых водах, псевдомонозы могут вызываться условно-патогенными или вирулентными штаммами P.fluorescens, P.putida. Они вызывают самостоятельные заболевания или осложняют другие инфекции. На возникновение данной инфекции большое влияние оказывает нарушение санитарно-гигиенического состояния водоемов, снижение резистентности организма рыб за счет воздействия стресс-факторов, травматизации, высокой скученности рыб и т.д.

В исследованных образцах рыбы и воды выявлена контаминация агентами, относящимися к грамотрицательной ферментирующей микрофлоре, сапрофитной и условно патогенных рас (рис.1). 

Рисунок 1. Колонии на среде МПА

На долю грамотрицательной неферментинующей микрофлоры приходилось значительное количество, это разнородные группы не образующих споры бактерий, в большинстве своём нетребовательным к условиям культивирования. К этим микроорганизмам были отнесены микроорганизмы рр. Pseudomonas и Aeromonas.

Исследования выявили значительное обсеменение внутренних органах рыб до 18х10⁶ КОЕ/мл микроорганизмами, растущими на среде МПА. Также выявлены микроорганизмы, растущие на среде Гильтая – до 10² - 10³ КОЕ/мл (табл.1). 

Таблица 1.

Микроорганизмы пораженных рыб

Проведенный микробиологический анализ и последующее выделение чистых культур микроорганизмов показали, что во внутренних органах рыб доминируют микроорганизмы, отнесенные нами на основе морфологического и масс-спектрометрического анализа к Aeromonas veronii обнаруженная в пресной воде и в значительном количестве в жабрах и внутренних органах рыб (рис.2). Это грамотрицательная палочковидная бактерия, с  округленными концами, диаметр клеток от 0,3-,0,5 мкм, длина 1,5-2,5 мкм. Встречается в виде одиночных палочек подвижны.  Для их точной идентификации применяли молекулярно-биологические методы в виду незначительных различий с бактериями рода Pseudomonas.

Этот микроорганизм может быть болезнетворным для человека и полезным симбионтом пиявок.У людей A.veronii может вызывать заболевания от раневых инфекций и диареи до сепсиса у пациентов с ослабленным иммунитетом.

Рисунок 2. Микрофотографии Aeromonas veroni (ув.1500 раз)

Кроме того, выявлены микроорганизмы, относящиеся к роду Pseudomonas, большей частью Pseudomonas aeruginosa – грамотрицательные подвижные бактерии с несколькими жгутиками. Клетки палочковидные, одиночные или соединены попарно, подвижные (движение поступательное), размеры 0,4-0,6 х 1,4-2,8 мкм. Споры отсутствуют. На исследуемых средах форма колоний круглая, поверхность гладкая. Профиль колоний выпуклый, край на обеих средах гладкий, реже волнистый. Колонии блестящие.

Идентификация выделенных культур до вида на основании морфолого-культуральных и физиолого-биохимических признаков подтверждена масс-спектрометрией и проведена на оборудовании «Малди» broker.

Представляют определённый интерес и имеют большое практическое значение исследования по выявлению устойчивости данных штаммов к антибиотикам. С целью дальнейшего подбора антибиотиков для борьбы с данной инфекцией нами была определена чувствительность Aeromonas veronii к следующим антибиотикам: стрептомицин, канамицин, эритромицин, линкомицин, нистатин, ампициллин (табл.2).

Таблица 2.

Чувствительность к антибиотикам

Проведенные исследования установили, что подавление роста Aeromonas veronii наблюдается при применении стрептомицина, канамицина и эритромицина. В меньшей степени линкомицина.

Заключение

Аквакультура в Узбекистане вносит существенный вклад в увеличение рыбной продукции и в воспроизводство ценных видов промысловых рыб. Широкое распространение получило прудовое рыбоводство по выращиванию толстолобика, белого амура и других рыб. В прудовых водоемах широко представлены белый и пестрый толстолобик и белый амур.  Одним из сдерживающих факторов дальнейшего развития прудового рыбоводства являются паразитарные болезни, которые наносят существенный экономический ущерб. Нами при санитарно-микробиологическом исследовании видов толстолобика исследуемых прудовых рыбоводных хозяйств выявлено обсеменение внутренних органах рыб бактериями. Выделены чистые культуры микроорганизмов, относящиеся к Aeromonas veronii и Pseudomonas fluorescens, которые способны поражать рыбу, вызывая их заболевания. В ходе обследования установлено подавление роста Aeromonas veronii при применении таких антибиотиков, как стрептомицин, канамицин и эритромицин, что показывает возможность применения этих препаратов для предотвращения заболевания рыб.

Важным является тот факт, что дальнейшее наращивание объемов производства и мощности будет неизменно сопровождаются ухудшением эпизоотического статуса и состояния здоровья объектов аквакультуры, что подтверждает необходимость должного ветеринарного контроля за ними.

Список литературы:

1. Антипчук А.Ф. Микробиология рыбоводных прудов на примере водоемов Украины. // М. Видавництво: Лег. и пищ. пром-сть Мова: Російська Обсяг: 1983, – С. 144-145.
2. Баринова С.С., Медведева Л.А., Анисимова О.В.  Экологические и географические характеристики водорослей-индикаторов. // Изд. «Водоросли-индикаторы в оценке качества окружающей среды». Ч.2., 2000, – 150 с.
3. Грищенко Л.И., Акбаев М.Ш., Васильков Г.В. Болезни рыб и основы рыбоводства. / М.,1999, – С. 332-338.
4. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. – М: Изд. МГУ, 2003, – 104 с.
5. Методические указания МУК 4.2.2884-11. Методы микробиологического контроля объектов окружающей среды и пищевых продуктов. М.: ФЦ Роспотребнадзора. 2011, – 24 с.
6. Низова Г.А., Лебедева Е.А. Заболевания рыб в аквакультуре Приазовья, новые методы и средства их профилактики. // Основные проблемы рыбного хозяйства и охраны рыбохозяйственных водоемов Азово-Черномоского бассейна. 2002-2003, – С. 309-314.
7. Чернышёва Н.Б., Кузнецова Е.В., Воронин В.Н., Стрелков Ю.А. Паразитологическое исследование рыб. // Методическое пособие. ФГНУ «Государственный научно-исследовательский институт озёрного и речного рыбного хозяйства», Санкт-Петербург, 2009, – 20 с.